Biologia Molecular, aula 1 21/07/2009 Introdução e motivação



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Biologia Molecular, aula 1 21/07/2009



Introdução e motivação

Francisco Prosdocimi

James Watson (juntamente com Francis Crick) descobriu a estrutura da dupla hélice do DNA em 1953, quando tinha apenas 25 anos. Neste texto ele nos conta a fabulosa história de desenvolvimentos das idéias que fundamentaram boa parte da biologia molecular que hoje vemos nos livros-texto. A apresentação de um texto original de Watson, traduzido do livro “A passion for DNA: Genes, Genomes and Society” (Uma paixão por DNA: genes, genomas e sociedade) tem o objetivo de divulgar um texto original de um dos maiores cientistas hoje vivos e mostrar ao aluno quão simples podem ser as grandes descobertas científicas, quão conturbado é o contexto histórico-científico e quão humanas são as pessoas que as realizam. Além de tudo, uma abordagem histórica de qualquer tema nos permite entender melhor como foi acumulado o conhecimento com relação a uma área do conhecimento em especial; no caso, a biologia molecular. Este professor também está convicto de que saber como foi estruturado o conhecimento do passado até o presente ajudará o aluno a ter suas próprias idéias e saber como proceder do presente até o futuro, boa sorte!

Neste relato, percebemos como Watson esteve sempre antenado com relação ao que diferentes grupos de pesquisa faziam em áreas relativamente próximas das quais ele mesmo trabalhava e mostra como estar atualizado com a pesquisa científica é importante para fazer uma ciência boa, criativa e de ponta.

Leia o texto com bastante atenção; ele resume, engloba e sintetiza de forma excepcional toda a nossa disciplina. Uma boa compreensão deste texto irá certamente ajudar o aluno a acompanhar a disciplina. Se não entender algo, volte e releia até entender. Lembre-se ainda que a biologia molecular simplesmente revolucionou praticamente todas as áreas da biologia desde que realmente se estabeleceu como campo de pesquisa sólido, a partir da década de 70. Não subestime a biologia molecular mesmo que você seja um naturalista, a biologia molecular hoje serve no mínimo como ferramenta para qualquer campo de trabalho em toda as ciências biológicas. Saber biologia molecular bem é ser um biólogo melhor e mais competitivo no mercado de trabalho. Leve seu próprio trabalho a sério.

As aulas serão divididas em exposições teóricas e estudos dirigidos como este. Aos alunos presentes no dia da aula será possibilitado responder as questões em grupos de até quatro pessoas. Aos alunos ausentes, o texto será disponibilizado no FTP e deverá ser respondido individualmente e entregue ao professor em mãos ou por e-mail (franciscop@ucb.br). Cópias e plágios serão punidos com nota Zero. Obs.: as figuras não estão presentes no texto original e foram adicionadas pelo professor a título de ilustração.



ATIVIDADE: Leia as questões abaixo e depois o texto, responda as questões. Dê respostas completas, inteligentes e criativas, não copie do colega.

  1. Qual a sua impressão geral sobre este texto escrito por um dos descobridores da dupla hélice e ganhador do Nobel? O que é possível apreender sobre a forma como ele escreve o texto e descreve a história da ciência que ajudou a fundar?

  2. O que o modelo de dupla hélice de Watson e Crick tornava imediatamente claro?

  3. Com relação a Gamow, responda:

    1. Qual problema ele tentava elucidar?

    2. Qual era a fundamentação básica (empírica) de seu modelo?

    3. O que Gamow não sabia sobre o modelo e por que isso era um problema?

    4. Apresente um desenho ou esquema que resuma o modelo de Gamow.

    5. Por que no modelo de Gamow existia uma restrição sobre quais aminoácidos poderiam ser vizinhos?

  4. Quando foi que Francis Crick desistiu de pensar em modelos do tipo Gamow e passou a pensar em novos modelos para o código genético? Em que se baseavam seus novos modelos? Por que Watson rejeitava tais modelos?

  5. Qual foi o papel do estudo de fagos e vírus no desenvolvimento inicial da biologia molecular? Por que sugeriu-se que o capsídeo do vírus TMV contivesse várias proteínas?

  6. Em que situações um RNA pode apresentar um padrão de difração de raios-X semelhante ao que encontramos no DNA?

  7. Repare na Figura 4. Depois de ter lido todo o texto você deve conseguir observar algum problema de cunho histórico nesta figura? O que é mostrado na Figura porém Crick ainda não conhecia? Dica: o conceito foi inventado posteriormente pelos franceses François Jacob e Jacques Monod.

  8. Por que Watson desistiu de trabalhar com a estrutura secundária de RNAs? Qual foi a sua idéia para deixar de trabalhar com isso e continuar desenvolvendo a biologia molecular?

  9. Em que consistem uns tais aminoácidos acilados de alta energia?

  10. Como eram chamados inicialmente os ribossomos? De que são compostos estes complexos? Segundo o relato de Watson, o que se sabia sobre eles que o fez se interessar por eles? Qual a estratégia Watson adotou para estudar os ribossomos? Esta estratégia foi efetiva? Por que?

  11. O que significa, no título, a palavra molde? Que molde é esse? Por que ele era necessário?

  12. Quais são as evidências, apresentadas em diversas partes do texto, que indicam que os ácidos nucléicos sejam os responsáveis pela transmissão da informação genética? O que você acha que era conhecido sobre os genes antes desta época? Dica: lembre-se das aulas de genética.

  13. Faça um histórico com datas contendo aqueles experimentos e desenvolvimentos que você considera os mais importantes e que ajudaram a construir a história inicial da biologia molecular, de acordo com o relato de Watson. Identifique, para cada experimento, qual a pergunta ele tentou responder.

  14. Este texto foi traduzido pelo professor e provavelmente contém erros. Você encontrou possíveis erros de tradução? Onde? Nota: o professor prefere boas críticas a condecorações. ;)

Fatos e Especulações Iniciais sobre os Moldes de RNA

James Watson (1993)

Traduzido por Francisco Prosdocimi

Fiquei sabendo de forma vívida sobre o RNA durante o outono de 1947 na Universidade de Indiana, quando realizei o curso de Salvador Luria sobre vírus. Aprendi então que, enquanto o já-conhecido fago Pox e o vírus Papiloma continham DNA, esta molécula estava completamente ausente tanto em vários vírus de plantas já purificados quanto em vírus que causavam encefalites, que por sua vez possuíam RNA. Aparentemente um dado vírus poderia ter tanto RNA ou DNA, ao contrário de células, que possuíam ambos. Mas estava ainda incerto à época se era mesmo o componente ácido nucléico que transportaria a informação genética. Assim, antes de entrarem na moda dos ácidos nucléicos, muitos cientistas queriam tentar estender as observações do experimento de Avery, MacLeod e McCarty sobre a transformação de pneumococos com DNA purificado a outras formas vida. O relatório de Al Hershey na primavera de 1952, dizendo que o componente de DNA do fago T2 carregava a especificidade genética, empolgou-me imediatamente, embora eu me lembre bem da indiferença do auditório quando no meio de Abril eu li uma carta de Hershey durante uma conferência em Oxford para a Sociedade de Microbiologia Geral.

Quando cheguei em Cambridge, no outono de 1951, eu levei bastante a sério o trabalho de Brachet e seus colaboradores em Bruxelas que enfatizavam a correlação entre o conteúdo de RNA e a capacidade de síntese protéica nas células. Essas células, fazendo grandes quantidades de proteínas, possuíam grandes números de partículas ribonucleoprotéicas de tamanho próximo ao de um vírus. Tais elementos eram conhecidos inicialmente como partículas microssomais e, a partir de 1958, como ribossomos. Ainda mais importante era observar que tais partículas haviam sido identificadas como os principais sítios para a síntese protéica através de sistemas artificiais (sem célula) recentemente criados para a síntese de proteínas. Neste ponto, o laboratório chave que seguia esta linha de pesquisa era o de Paul Zamecnik, do hospital de Massachusetts. Igualmente importante era a demonstração por Brachet e Cahantrenne de que o núcleo e, portanto, o DNA, não tinha participação direta na síntese protéica. Para demonstrar isso, eles cortaram a alga gigante Acetabularia em duas metades e observaram que a metade sem núcleo podia manter uma síntese de proteínas normal por mais de um mês. Ainda assim, a partir dos resultados de Beadle e Tatum sobre o modelo um gene-uma enzima (proteína), sabia-se que a fonte última de informação genética que especifica a seqüência de aminoácidos de uma proteína deveriam ser os genes encontrados no núcleo. Eu então postulei um esquema de dois estágios para a síntese protéica no qual o DNA primeiro servia como molde para uma síntese de RNA no núcleo da célula. Este RNA por sua vez mover-se-ia até o citoplasma onde funcionaria como molde para a síntese protéica.

Ninguém, entretanto, tinha nenhuma razão em particular para levar minha hipótese a sério, mas em Novembro de 1952 eu gostei o suficiente desta hipótese para imprimir um DNA→RNA→>proteína num pequeno pedaço de papel que eu preguei na parede, sobre minha escrivaninha, no meu quarto do Clare College. Desde o dia de nosso primeiro encontro, Francis Crick e eu pensamos que seria altamente provável que a informação genética do DNA fosse codificada por sua seqüência de quatro bases. Sabíamos que seria prematuro promover esta idéia antes que a estrutura do DNA fosse conhecida. Entretanto, no momento que nós primeiramente vimos como construir uma dupla hélice a partir das quatro bases, estava claro que as particularidades de um gene deveriam residir na sua respectiva seqüência de pares de bases. Além disso, o modelo de pareamento de bases não apenas mostrava a forma como os genes poderiam ser exatamente copiados durante a duplicação de genes, mas também poderia muito provavelmente descrever o processo através do qual a informação genética da molécula de DNA seria transferida para seu produto de RNA.





Figura 1: A famosa cristalografia de raios-X do DNA produzida por Rosalind Franklin que serviu de base para o modelo de Watson e Crick. “(...) eu continuava esperando que uma boa idéia sobre a construção do modelo faria o truque e que eu pudesse realizar meu objetivo sem que minha completa ignorância de física fosse jamais revelada” (Watson, A passion for DNA, p. 20).

Ainda totalmente desconhecida, entretanto, era a forma como o RNA poderia servir como molde para ordenar os aminoácidos com relação aos produtos polipeptídicos. Confiantes depois de nossa fantástica sorte em encontrar uma essência estrutural tão simples para o processo de duplicação gênica, eu não via nenhuma razão para não aceitar o desafio de descobrir como as moléculas de RNA se comportavam em três dimensões. Tal conhecimento, eu acreditava, seria indispensável para o entendimento de como elas funcionariam na síntese de proteínas. Esta tarefa eu levei a cabo quando me mudei para Pasadena, no outono de 1953. Lá eu juntei forças com Alex Rich, que havia começado a trabalhar com o DNA logo antes de nossa descoberta da dupla hélice. Não enfrentei dificuldades em convencê-lo a mudar seu foco de pesquisa para um assunto melhor e rapidamente eu estava coletando amostras de RNA e produzindo-as em fibras que Alex expunha aos feixes de raios-X. Mas apesar de todo esse trabalho, mesmo aquelas fibras que mostravam birefringência nunca davam lugar a padrões de difração ordenados como aqueles do DNA. Ainda que pensássemos ver reflexões que poderiam vir de pequenas regiões de dupla hélice, nós jamais podíamos estar convictos disso e não víamos como decidir se o RNA era uma molécula de hélice dupla ou simples. Aqui, a composição de bases era um problema. RNAs virais não mostravam equivalência de A com U ou G com C, ainda que RNAs de células tivessem composições de A/T e G/C normalmente próximas a 1/1. Mas nós não podíamos ver nenhuma diferença em padrões gerais dos diagramas de raios-X a partir dos RNAs virais ou celulares. Para nossa preocupação, o RNA vindo de qualquer fonte mostrava diagramas de raios-X caracterizados por reflexões a 3.36 Å e 4 Å. Claramente existia alguma estrutura ordenada no RNA, mas não víamos nenhuma forma de chegar a ela. Depois de seis meses de frustrações, desistimos.

Uma abordagem diferente para a síntese de proteínas veio de um físico teórico muito esperto, nascido na Rússia. George Gamow estava absorto pelo fato de que a distância de 3.6 Å entre aminoácidos adjacentes durante a síntese de cadeias polipeptídicas era bastante similar à separação de 3.4 Å entre as bases adjacentes na forma B da dupla hélice. Mesmo sem conhecer o papel primário do RNA na síntese de proteínas, Gamow propôs que os aminoácidos fossem diretamente ordenados por contatos com as bases do DNA. Neste modelo, os produtos polipeptídicos conteriam o mesmo número de aminoácidos quanto as bases no molde do DNA. Para tratar do fato de que o DNA tinha apenas quatro letras em seu alfabeto enquanto existiam vinte diferentes letras (aminoácidos) utilizadas para especificar proteínas, Gamow assumiu que cada aminoácido deveria ser codificado por pares de bases adjacentes. Como existiam apenas 16 (4 x 4) combinações de quatro bases, duas a duas, Gamow assumiu que cada aminoácido deveria ser especificado por grupos de três bases adjacentes (um códon) ao longo da cadeia de DNA. Para então tratar do fato de que existiam 64 (4 x 4 x 4) de tais tripletes, ele assumiu que muitos aminoácidos deveriam ser especificados por mais de um triplete (tripletes redundantes). Neste código “sobreposto”, códons para aminoácidos adjacentes teriam duas bases em comum, portanto restringindo quais aminoácidos poderiam ser vizinhos um do outro. O primeiro código sobreposto de Gamow foi apenas um dos vários que posteriormente foram descritos, cada um levando a diferentes combinações proibidas de aminoácidos adjacentes.





Figura 2: Código com e sem sobreposição de bases. No código de Gamow (overlapping), as duas bases finais de cada trinca são reaproveitadas para codificar o próximo aminoácido e, assim, devem existir combinações proibidas de aminoácidos vizinhos. (Retirado de Lehninger)

Quando George contou-me pela primeira vez seu esquema, eu rapidamente rejeitei-o por que o DNA não era o modelo que ordenava os aminoácidos. Entretanto ele estava se divertindo com a análise combinatória e, de qualquer forma, eu não poderia ainda descartar a possibilidade de que algumas moléculas de RNA formassem hélices duplas. Com o tempo ainda, eu percebi que havia uma real virtude nos códigos como os de Gamow. Ao prová-los falsos, a possibilidade de códigos com códons sobrepostos sairia de cena, apontando o caminho para códigos nos quais grupos adjacentes de provavelmente três bases especificariam os aminoácidos sucessivos numa cadeia polipeptídica. De fato, a primeira seqüência de aminoácidos produzida, a de Sanger para a insulina, refutava seu primeiro código, ainda que Gamow não se apercebesse disso, posto que tinha uma lista de 20 aminoácidos contendo vários erros desconcertantes (por exemplo, ele incluía tanto cistena quanto cisteína). Outros códigos com sobreposição de bases foram produzidos no ano seguinte à medida que novas seqüências de proteínas iam sendo descobertas. Foi exatamente durante este primeiro e excitante momento de busca por um código que Leslie Orgel e eu, numa viagem a Berkeley, onde Gamow passava a primavera de 1954, sugerimos a formação de um clube de 20 membros cujo propósito seria decodificar a estrutura do RNA e assim entendermos como o código genético operava. Rapidamente conhecido como o RNA Tie Club (Clube Gravata do RNA), com seus membros refletindo o gosto eclético de Gamow, nunca tivemos um único encontro formal. Nem mesmo todos seus membros tiveram dinheiro para adquirir suas gravatas de RNA e os bótons com seu respectivo aminoácido. O bótom de Gamow mostrava ALA (Alanina) e o meu PRO (Prolina). Mais importante do que tudo isso era a oportunidade de trocarmos idéias sobre o código através de cartas conhecidas como “notas para o RNA Tie Club”.





Figura 3: Quatro dos vinte membros do RNA Tie Club, onde cada membro tinha o nome de um aminoácido. Na foto, estão Francis Crick (à esquerda, atrás); Leslie Orgel (ao lado de Crick), Alex Rich (à frente, esquerda) e James Watson (direita, à frente).

Várias dessas comunicações, sendo a mais importante vindo de Francis Crick, Leslie Orgel e Sidney Brenner, posteriormente eram incorporadas a trabalhos científicos. Dentre essas cartas estava a refutação definitiva de Sydney Brenner de qualquer forma de código por superposição, escrita em outubro de 1956 quando ele estava em Joanesburgo, logo antes que retornasse à Inglaterra para se juntar a Crick. Igualmente importante foi a comunicação de Crick, John Griffiths e Leslie Orgel sobre um código sem vírgulas como alternativa a permitir que códigos não sobreponíveis pudessem ser lidos na fase aberta de leitura apropriada. Mas o trabalho intelectualmente mais influente do RNA Tie Club foi justamente sua primeira nota, escrita por Francis Crick e enviada no início de 1955 sob o título “Sobre moldes degenerados e a hipótese do adaptador” (On degenerate templates and the Adaptor Hypothesis). Depois de gastar o agosto anterior em Woods Hole brigando sobre códigos potenciais com Gamow e Brenner, Crick começou a questionar a premissa básica que um modelo de ácido nucléico contivesse cavidades específicas e complementares, em forma e carga, às cadeias laterais dos aminoácidos. Aqui ele argumentava que partes específicas das bases nitrogenadas precisariam realizar pontes de hidrogênio e nem todas seriam capazes de formar cavidades que pudessem atrair as cadeias hidrofóbicas de aminoácidos como valina, leucina ou isoleucina. Igualmente estranho era imaginar uma base estrutural para os códigos degenerados nos quais muitos grupos laterais de aminoácidos fossem especificados por mais de um grupo de tripletes. Em vista de tais obstáculos que Crick considerou insuperáveis, ele fez uma proposta radical sugerindo que, antes da ligação peptídica, os aminoácidos seriam enzimaticamente ligados a pequenas moléculas “adaptadoras” que teriam superfícies especificamente desenhadas para ligar tripletes de ácidos nucléicos. Crick sugeria neste trabalho que tais adaptadores poderiam ser pequenos polinucleotídeos que fariam pareamentos de base com os moldes de RNA.





Figura 4: A hipótese do adaptador de Crick, onde uma molécula intermediária era necessária para traduzir a linguagem do DNA para a linguagem das proteínas. (Retirado de Lehninger, cap 27, pag 1035).

Minha reação à hipótese do adaptador foi inicialmente muito negativa, mesmo considerando que eu havia gasto todo o outono de 1954 futilmente a tentar empacotar cadeias de RNA em formas que contivessem cavidades apropriadas para as cadeias laterais dos aminoácidos. A idéia do adaptador parecia muito complicada para ter acontecido na origem da vida, vários bilhões de anos atrás. De fato, mesmo Francis tinha momentos de hesitação, tendo concluindo seu artigo no RNA Tie Club com a seguinte frase: “No meu completo isolamento em Cambridge eu devo confessar que havia horas em que eu não tinha mais estômago para realizar a decodificação.” Realmente, logo depois que voltei a Cambridge para o ano letivo que começaria em Junho de 1955, Francis e Alex Rich passaram a ficar imersos em construir novos modelos tridimensionais para o colágeno de forma a competir com um modelo anterior proposto por Linus Pauling. E isto apesar do fato de que Francis e eu havíamos nos referido ao colágeno como a mais sem-graça de todas as moléculas.

Igualmente frustrado, passei a pensar sobre vírus de plantas – em particular o vírus mosaico do tabaco (TMV) – cuja construção helicoidal eu já havia observado na primavera de 1952 depois de Francis e eu termos sido alertados por Sir Lawrence Bragg a parar de tentar trabalhar com a estrutura do DNA através da construção de modelos. Sempre me pareceu problemática a necessidade de postular tanto a transmissão genética quanto a síntese de proteínas ao RNA. Assim, sabendo que apenas uma pequena fração de partículas do TMV era de fato infecciosa, especulei se estas raras partículas não continham DNA ao invés de RNA. Esta possibilidade, entretanto, foi deixada para trás quando se tornou possível reconstituir partículas infecciosas de TMV a partir do RNA purificado e de seus componentes protéicos. Este experimento, o primeiro realizado com sucesso na primavera de 1955, em Berkeley, por Heinz Fraenkel-Conrad e Robley Williams, gerou muita publicidade em jornais e revistas ao sugerir ao leitor não-informado de que havia sido possível ser criar vida em laboratório. Francis, entretanto, diminuiu o impacto do experimento ao dizer para a imprensa inglesa que esses resultados eram algo que ele já havia antecipado.

O fato dos pesquisadores terem sido capazes de reconstituir o fago, entretanto, não respondia à questão sobre se o componente protéico tinha algum papel além de fornecer uma capa-de-proteção para a informação genética contida no componente de RNA. Menos de um ano depois, entretanto, Alfred Gierer, trabalhando no laboratório de Gerhard Schramm em Tubingen, claramente mostrou que o RNA sozinho era infeccioso. Esta primazia dos ácidos nucléicos como repositórios da informação genética estava no núcleo daquilo que Francis e eu pensávamos sobre células e vírus. Mas estava longe de ser um paradigma aceitável para muitos dos congressistas da conferência realizada pela Fundação CIBA sobre a estrutura de vírus, ocorrida no fim de março de 1956. Eles não se sentiam confortáveis com o conceito de que a informação fluía unidirecionalmente dos ácidos nucléicos para as proteínas e nunca ao contrário. Isso ficou claro quando Andre Lwoff e eu passamos para Robley William uma mensagem telegrafada que falamos ter sido escrita por Wendell Stanley onde se lia: “proteínas infecciosas de TMV – tome cuidado!”. Para nossa surpresa, Robley não questionou o resultado até que tivéssemos contado-lhe da fraude.

Nesta reunião de cerca de 30 cientistas, Francis apresentou nossas idéias sobre porque a capa protetora dos vírus seria feita de subunidades protéicas. Em nossa opinião isso era conseqüência do fato de que nenhum ácido nucléico viral tinha capacidade de codificar um único polipeptídeo de cadeia grande o suficiente para envolver um núcleo localizado centralmente e composto de tais ácidos nucléicos. O RNA do vírus do tabaco apresentava um peso molecular igual a 2 milhões e continha apenas 6000 bases. Assumindo uma taxa de três bases por aminoácido, ele seria capaz de especificar uma proteína de 2000 aminoácidos, que teria um peso molecular próximo a 230.000. Para formar, assim, uma proteína de revestimento de peso molecular igual a 38 milhões como era observada, pelo menos 160 subunidades seriam necessárias. De fato, cada subunidade do envelope do TMV continha apenas 150 aminoácidos, sugerindo que o RNA do TMV codificava várias proteínas ou que a taxa era muito maior do que três. Inicialmente pensamos que o vírus TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus) que apresentava um conteúdo de RNA muito maior deveria ser utilizado com mais propriedade para fornecer um valor mais realista da taxa de codificação. Ele continha no máximo quatro bases para cada aminoácido na sub-unidade cristalográfica. Entretanto, uma posterior análise cristalográfica mais direta de seu conteúdo protéico mostrou que as repetições cristalográficas continham cerca de cinco subunidades protéicas, muito provavelmente implicadas no fato de que o RNA de TBSV, assim como o de TMV, também codificava diversas proteínas.

Depois desta conferência eu novamente voltei a trabalhar com estrutura de RNA, aproveitando a descoberta da enzima polinucleotídeo fosforilase, que Marianne Grunberg-Manago e Severo Ochoa encontraram e que poderia ser utilizada para criar moléculas sintéticas de RNA. De volta ao NIH, Alex Rich havia demonstrado no mês anterior que polímeros de AU e AGCU gerados aleatoriamente tinham padrões tridimensionais similares na difração por raios-X àqueles produzidos utilizando tanto RNA purificado de células quanto RNAs virais. Eu estava mais interessado em fibras de Poli-A obtidas de um material preparado no Moldeno Institute por Roy Markham e David Lipkin. Para minha satisfação, eles produziram um diagrama de raios-X helicoidal muito claro que era mais bem interpretado como uma hélice dupla produzida por duas cadeias paralelas de Poli-A. Inicialmente eu fiquei preocupado pelo fato de que muitas das reflexões-chave eram sobrepostas com aquelas geradas por RNA purificado, o qual tínhamos razões para acreditar que era composto por uma cadeia simples. Posteriormente este aparente paradoxo foi resolvido ao descobrirmos que ganchos (hairpins) podiam ser produzidos por ligações de hidrogênio entre bases na mesma fita na maioria das cadeias de RNA. Claramente, nestas pequenas regiões as duplas hélices imperfeitas produziam padrões de raios-X tipo-DNA em amostras de RNA.





Figura 5: Mesmo sendo uma molécula de fita simples, o RNA pode apresentar regiões internas onde suas bases façam pareamentos Watson-Crick (A=U, C=G). Tal pareamento interno simula uma dupla-hélice na molécula.

À época desencorajado de que o estudo do RNA purificado levaria ao entendimento de como a síntese de proteínas ocorria, decidi concentrar-me na estrutura das partículas ribossomais, acreditando que elas deveriam carregar a informação genética para ordenar os aminoácidos nas proteínas. Naquela primavera de 1956, eu havia convencido Alfred Tissieres, então uma amigo do Kings’ College trabalhando no Molteno Institute em oxidação fosforilativa, a juntar-se a mim em Harvard, para onde eu estaria me mudando no outono de 1956. Alfred, na verdade, tinha realizado alguns experimentos preliminares nas então-chamadas partículas microssomais e estava querendo seguir nesta linha de pesquisa.

Cheguei em Harvard cerca de seis meses antes de Alfred, preocupado desta vez em tentar ser um bom professor para os estudantes no início ou fim da graduação que estavam cursando minha disciplina sobre vírus. Logo que minhas aulas estavam sob controle, atravessei o Charles River para me encontrar com Paul Zamecnik, a quem eu tinha encontrado pela primeira vez no ano anterior quando passava por Harvard, em meu retorno à Inglaterra. Ali no prédio onde também trabalhava Fritz Lipmann, eu inicialmente entendi a importância da descoberta (feita um ano antes por Mahlon Hoagland) de certos intermediários da síntese protéica que consistiam em aminoácidos acilados de alta energia. Ainda mais importante, eu aprendi sobre as mais recentes observações (por Mahlon, Marjorie Stephenson e Paul) de uma fração solúvel do RNA (sRNA) a partir das quais aminoácidos ativados eram ligados antes da síntese protéica. Rapidamente eu percebi que essas moléculas de sRNA poderiam ser os polinucleotídeos adaptadores postulados dois anos antes por Francis quando estávamos na conferência de 1957 sobre ácidos nucléicos e proteínas.

Tissieres e eu começamos a caracterização molecular de ribossomos de E. coli na primavera de 1957, suspeitando que deveriam existir planos estruturais como aqueles dos pequenos RNAs de vírus, cujas conchas protéicas de forma icosaédrica eram formadas de uma única cadeia polipeptídica. Não poderíamos estar mais enganados sobre como eles eram organizados. Só para começar, descobrimos que os ribossomos de E. coli, como o dos outros organismos, eram formados pela agregação de duas subunidades que continham também RNA, sendo que a maior unidade (50s) continha aproximadamente duas vezes o tamanho da subunidade menor 30s. Cada subunidade era composta de um componente maior de RNA, sendo que a subunidade ribossomal 50s possuía uma cadeia de RNA 23s e a subunidade 30s continha uma cadeia de RNA 16s. Além disso, ambas continham um grande número de pequenas proteínas cuja maior parte era sub-unidade específica. Em baixos níveis de Mg2+, as unidades 30s e 50s não se associavam, mas quando a concentração de Mg2+ era elevada, elas ficavam juntas para formar o complexo 70s que trabalhos subseqüentes mostraram ser a forma ribossomal que efetivamente leva a cabo a síntese de proteínas.



Inocentemente, a princípio, assumimos que ou o RNA 16s ou o RNA 23s ou ambos seriam os moldes reais para a síntese de proteínas. Era curioso para nós, entretanto, como os moldes existiam em apenas duas classes de tamanho enquanto existia uma grande variação nos tamanhos dos produtos polipeptídicos. Igualmente estranho era porque a composição de bases dos RNAs ribossomais variava pobremente entre espécies bacterianas com diferentes taxas de AT/GC. A priori esperávamos descobrir que a composição de bases dos moldes de RNA deveriam refletir aqueles dos moldes de DNA. Tivemos sorte de haver ao menos uma poderosa exceção. Volkan e Astrachan haviam demonstrado, em 1956, que o RNA do fago T2-específico, produzido depois de uma injeção de T2 em E. coli, tinha a mesma composição de bases do DNA de T2. Além disso, ao contrário das cadeias altamente estáveis do RNA ribossomal, o RNA de T2 era altamente instável e tinha uma meia-vida de apenas alguns minutos.

Em retrospecto, vejo que Tissieres e eu deveríamos ter ido trabalhar logo com o RNA de T2, mas de fato apenas após o outono de 1959 que suas propriedades moleculares foram mais bem investigadas. Masayasu Nomura e Bem Hall, trabalhando com Sol Spiegelman na Universidade de Illinois, forneceram evidências da incorporação do RNA de T2 em ribossomos menores do que o normal. Tentando então seguir com esta observação no início de 1960, meu estudante de pós-graduação, Bob Risebrough, veio com uma conclusão totalmente diferente. Após a síntese do T2-RNA, ele não se torna parte da unidade ribossomal por agregação com as proteínas ribossomais. O que de fato estava acontecendo era que na presença de Mg2+, o T2-RNA se ligava à subunidade menor do ribossomo que, posteriormente, ligava-se à maior pra formar o complexo 70s e realizar a síntese de proteínas. Este resultado modificou instantaneamente a forma segundo a qual nós visualizávamos a síntese protéica. Ao invés de servirem no papel de moldes, os ribossomos funcionavam como sítios estáveis onde ocorria a síntese de proteínas. O verdadeiro molde deveria ser um novo RNA de classe desconhecida até o momento tanto porque ele estaria em pequenas quantidades do total de RNA da célula e porque ele deveria ser heterogêneo em tamanho. Posteriormente, tais moldes metabolicamente instáveis, cuja quantidade correspondia às necessidades celulares, seriam batizados como RNA mensageiro (mRNA) por Jacques Monod e François Jacob.





Figura 6: A seqüência de etapas hoje conhecidas para a iniciação da síntese de proteínas. Primeiro a subunidade menor do ribossomo liga-se ao RNA mensageiro (1), depois o tRNA carregando a metionina liga-se ao complexo (2) e finalmente a subunidade maior chega e o processo de tradução pode acontecer em ritmo acelerado (3).

A primeira pessoa de fora do laboratório a quem eu revelei esta enorme novidade conceitual foi Leo Szilard, a quem eu havia ido visitar em Nova Iorque no início de abril de 1960 e que se recuperava de uma radioterapia que curaria seu câncer na bexiga. A reação de Leo foi totalmente negativa, não estando convencido de que tínhamos a correta interpretação dos experimentos de Risebrough. Ele queria então que mostrássemos que o RNA mensageiro existia em células de E. coli não infectadas antes que ele pudesse mudar de idéia sobre o assunto. Estes eram experimentos que, de fato, tínhamos planejado realizar dentro de algumas semanas, tão logo François Gros chegasse de Paris para passar alguns meses trabalhando com Alfred e eu. Em pouco tempo também, juntar-se-ia a nós Wally Gilbert, que à época ainda dava aulas de física teórica para estudantes de Harvard mas que estava tentado se mover para a biologia molecular dada nossa empolgação sobre o mRNA. Já na época da conferência June Gordon sobre ácidos nucléicos, estávamos virtualmente convencidos de que o RNA mensageiro de E. coli existia e lá pelo fim do verão tínhamos acumulado dados suficientes para uma publicação convincente. Já na conferência Gordon, ouvimos rumores de que Sydney Brenner e François Jacob, utilizando argumentos muito diferentes, tinham também postulado a existência do RNA mensageiro. A idéia deles estava sendo testada por Sydney naquela semana, no laboratório de Matt Meselson na Caltech. Eventualmente, acabamos publicando nossas provas independentes da existência do RNAm no início de 1961, em dois artigos conjuntos publicados na Nature.



Com o esquema básico sobre como o RNA participava da síntese de proteínas, o caminho se tornou aberto para experimentos definitivos sobre a natureza do código genético. Utilizando RNA mensageiros sintetizados enzimaticamente para a síntese de proteína in vitro, no início de 1966 todos os tripletes codônicos já tinham seu correspondente aminoacídico correto conhecido. Com este objetivo maior alcançado, a questão agora seria como o fluxo DNA→RNA→proteína teria um dia começado. Aqui novamente Francis estava à frente de seu tempo. Em 1968, ele argumentou que o RNA teria sido a primeira molécula carregadora da informação genética e posteriormente sugerindo que o RNA, além da atividade como molde, também deveria atuar como enzima e assim que ele poderia catalisar sua própria auto-replicação. Como ele estava certo!



Figura 7: O código genético. Toda a história inicial da biologia molecular apresentada neste ensaio de Watson culmina com a montagem final do código que liga o mundo dos ácidos nucléicos ao mundo das proteínas. Sendo basicamente mesmo em todos os organismos vivos, o código genético é hoje uma das maiores provas da ancestralidade comum entre os organismos e da evolução darwiniana, observada em nível molecular.


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