CaracterizaçÃO, isolamento e identificaçÃo de fungos endofíticos da



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CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DA Ricinus communis L. (MAMONA) COM APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA.

Evandra Mello Pereira, Roseli Aparecida de Mello , Maria Luiza Fernandes Rodriguez.



Universidade Tuiuti do Paraná ; roseli.mello@utp.br

O gênero Ricinus é pertencente a família Euphorbiaceae, que compreende cerca de 290 gêneros e aproximadamente 7.500 espécies, distribuídas em todo o mundo, mas principalmente nas regiões tropicais (LIMA, 2006). Popularmente chamada de mamona, carrapateira, rícino e palma-de-cristo . A mamona pode apresentar plantas de porte alto, médio ou baixo, com caule ramificado com coloração verde, avermelhada ou verde amarelada. As folhas são simples, alterno-espiraladas, longo-pecioladas, plenas ou sulcadas, com lobos dentados. A cultura da mamona é explorada industrialmente em função do óleo contido em suas sementes, a China, a Índia e o Brasil são os principais produtores mundiais de mamona , (VARGAS, 2006; AZEVEDO, 2001). O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de mamona. Atualmente ela vem sendo pesquisada e utilizada como uma fonte alternativa para a substituição dos produtos originários de petróleo, principalmente o Biodiesel (MOREIRA, 2009). O biodiesel consiste num substituto natural do óleo diesel e que pode ser produzido a partir de fontes renováveis, a sua utilização está associada à substituição parcial de combustíveis fósseis (CARNEIRO, 2003). Segundo Vargas (2006), o Programa Nacional de Biodiesel regulamenta e autoriza o uso comercial deste produto em todo o território nacional e estabelece os percentuais de mistura do biodiesel ao diesel de petróleo, a forma de utilização e o regime tributário é regulamentado com diferenças por região de plantio, por oleaginosa e por categoria de produção. Esses instrumentos autorizaram, a partir de 2005, a adição de 2% de biodiesel ao diesel de petróleo, (SAVY FILHO,2005). As interações entre as plantas e microrganismos já são conhecidas há muito tempo. Entretanto, com exceção da associação de plantas com fungos micorrízicos, acreditava-se que estas interações levavam à formação de lesões nos tecidos vegetais. Mais recentemente, vem sendo registrada a presença de microrganismos no interior de tecidos vegetais sadios, abrindo novas perspectivas para o estudo da interação planta/microrganismo estes, São considerados microrganismos endofiticos ou seja, aqueles que habitam o interior das plantas pelo menos durante um período do ciclo de vida da mesma sem lhes causar danos ou doença. Apesar de devidamente comprovada a existência da microbiota endofítica, muitas pesquisas ainda deverão ser feitas a respeito de aspectos ecológicos, genéticos e fisiológicos dessa interação. Antes disso, é interessante se conhecer a diversidade desses organismos, sua presença, freqüência e funções. Essa relação endofítica pode ter surgido quando do aparecimento dos vegetais superiores no planeta, ou seja, há centenas de milhões de anos (STROBEL, 2002). Existe uma série de razões para que se aprofundem os estudos com endofíticos. Primeiro, a falta de informações para elucidar a base biológica dessas interações. Segundo, porque os endofíticos são vantajosos, pois muitos benefìcios para a planta têm sido atribuído à presença deles tais como a capacidade de produzir antibióticos e outros metabólicos secundários de interesse farmacológico; podem servir como bioindicadores de vitalidade (Helander & Rantio-Lehtimaki, 1990); têm sido usados como agentes de controle biológico de pragas e doenças; têm sido usados como bioherbicidas; podem ser usados na biorremediação de solos contaminados com poluentes entre outros. A produção de metabolitos primários e secundários pelos microrganismos é conhecida há muito tempo e explorado do ponto de vista biotecnológico. Os exemplos mais conhecidos são os antibióticos. Mas outros metabolitos com as enzimas também são produzidas pelos fungos, Muitos estudos tem demonstrado que as plantas em algum período da vida apresentam estes fungos, entretanto a relação entre os endofíticos e seus hospedeiros ainda não foi bem definida.

Desta forma, justifica-se o interesse em elucidar aspectos da biologia destes microrganismos, para compreender melhor a sua relação com a planta hospedeira e seu papel na produção de novos princípios bioativos.



Materiais e Métodos

As folhas da mamona foram coletadas no campus Schaffer da Universidade Tuiuti do Paraná. As folhas coletadas aparentavam aspecto sadio e pertenciam a plantas já adultas. O reconhecimento da planta deu-se segundo Joly et. al.(2002).

O material botânico coletado foi processado no prazo de 24 horas. Após a coleta as plantas foram lavados abundantemente com água corrente e detergente neutro para retirar o excesso de epifíticos, matéria orgânica e resíduos sólidos. Antes do processo de desinfecção externa os pecíolos foram vedados com parafina, a fim de evitar que os agentes de desinfecção penetrem por essa abertura, alterando o resultado real do isolamento. Em seguida, em câmara asséptica, as folhas lavadas em água destilada esterilizada por duas vezes e posteriormente o material foi imerso em álcool 70% por 1 minuto,em seguida em hipoclorito 3% por 4 minutos e novamente em álcool 70% por 30 segundos, para retirar o excesso de hipoclorito. Então o material foi lavado três vezes em água destilada estéril da qual foi retirado 50 μL para fazer o controle da assepsia (SOUZA et. al., 2004).

As folhas cortadas em fragmentos circulares de aproximadamente 6 mm foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultivo batata, dextrose e ágar (BDA), acrescido de tetraciclina (100mg/L) para isolamento de fungos. As placas com os fragmentos foram incubadas a 28ºC e 37 ºC.

O crescimento das colônias fúngicas foi acompanhado diariamente. À medida que surgiram, foram transferidas para tubos de ensaio contendo BDA e cultivados a temperatura ambiente (28 ± 2 ºC), e depois armazenadas a 4ºC.

As colônias de morfologia similar foram agrupadas, com a finalidade de facilitar o estudo. Em seguida, os grupos foram repicados para tubos de ensaio contendo meio BDA ou TSA , para garantir a presença de apenas um exemplar na amostra a ser posteriormente identificada.

Para purificação dos isolados fúngicos, esporos de cada um dos isolados foram homegeneizados em solução de Tween 80 a 0,1 %, e alíquotas de 0,1 mL semeadas em placas de Petri contendo meio BDA com auxílio da alça de Drigalski. As placas incubadas à temperatura ambiente (28 ± 2 ºC), conforme descrito por Pimentel et al. (2006).
Após 7 dias obtiveram-se os primeiros crescimentos, foram os grupos A, B, C, D e E. Com 16 dias na estufa surgiu um segundo grupo que foram definidos como F, G, H, I, J, K, L, M e, com 20 dias cresceram o terceiro e último grupo que foram designados em N, O, P, Q, R. As placas que restaram foram observadas até 30 dias, porém não apresentaram crescimento algum.

Os grupos obtidos, de A até R, foram subdivididos numericamente conforme a quantidade e diversidade de fungos que cada placa continha, obtendo-se a placa A-1, A2, A3 e assim sucessivamente.


Resultados e Discussão

Os fungos endolíticos obtidos foram facilmente isolados das folhas dentre os cultivares de mamona analisados, sendo obtidos 53 isolados de colônias fúngicas agrupas conforme similaridade morfológica. Entre os fungos isolados foram identificados os gêneros: Colletotrichum sp, Curvularia sp , Aspergillus sp, Penicillium sp, Scidosporium sp, Clodosporium sp. Alguns fungos endofiticos não apresentaram estruturas reprodutivas, não sendo possível realizar sua identificação até o presente momento. O fungo com maior incidência foi o Aspergillus sp.

Segundo Pimentel (2006), Os fungos endofíticos podem agir de maneira antagônica, neutra ou até benéfica para o vegetal hospedeiro, exibindo vários graus de interdependência fisiológica e ecológica. Muitas vezes, os metabólitos produzidos por fungos endofíticos podem ser neutros ou terem ação antagônica para o hospedeiro. Em outros casos, são de grande importância para a farmacologia. Já Silva et al (2006), afirma que Microrganismos endofíticos têm sido associados com a promoção do crescimento de várias culturas de hortaliças, ainda Silva et al (2006) demonstra que há vários mecanismos descritos sobre como endofíticos promovem o crescimento dos vegetais que os abrigam. A fixação do N2 atmosférico é um mecanismo bem estudado e há vários exemplos descritos na literatura de isolamento de endofíticos com capacidade de fixar nitrogênio e disponibilizá-lo às plantas. Existem pesquisas que comprovam a ação antioxidante, de grande importância para a indústria de cosméticos, e antitumorais, que podem parar o desenvolvimento ou até impedir a formação de tumores de alguns fungos somente quando endofíticos. (STROBEL et al., 1997; PIMENTEL, 2006). Vários estudos vêm demonstrando a importância biotecnológica de fungos endofíticos. Lu et al. (2000) constataram atividade de três novos metabólitos produzidos pelo fungo Colletotrichum sp., isolado da planta medicinal. Endofíticos exercendo atividade inibitória in vitro contra fitopatógenos têm sido estudados e relatados.( silva, 2006). Shimizu et al. (2002) estudaram a produção de substâncias antimicrobianas por um actinomiceto endofítico e sua atividade antifúngica. Os Microrganismos endofíticos constituem uma fonte potencial de produtos naturais poucos explorados, comparados a vegetais. A maioria das pesquisas com endofiticos ocorrem em outros países. Poucos são as pesquisas nas regiões tropicais. As pesquisas com plantas de regiões tropicais tem demonstrado que estas tem um diversidade enorme de microrganismos endofíticos, muitos ainda desconhecidos, calcula-se que muitos destes fungos possam produzir metabolitos de interesse biotecnológico. Strobel e Daisy (2003) afirmam que a seleção de plantas hospedeiras sejam de interesse, biológico, químico; e biotecnológico. A mamona possui estas características, portanto torna-se uma candidata para estudos e isolamentos.

Concluindo a mamona apresenta fungos endofíticos. Estudos e novos isolamentos deverão ser realizados para verificar a predominância dos gêneros isolados neste experimento e comparar com os presentes na literatura. Também sugere-se que novos ensaios biológicos sejam realizados para verificar o potencial de propriedades biologicamente ativas produzidas por estes e outros microrganismos isolados.








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