Guilherme ambar



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GUILHERME AMBAR


Efeitos da administração prolongada do esteróide anabolizante decanoato de nandrolona em comportamentos emocionais e na expressão de genes relacionados ao sistema serotoninérgico em diferentes áreas cerebrais de camundongos



Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Psiquiatria

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Chiavegatto



SÃO PAULO

2008

Dedico este trabalho aos meus pais, pelo

respeito, apoio e compreensão incondicionais.



O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são.”

Aristóteles

Agradecimentos


Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio recebido durante a realização deste projeto, e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro destinado ao presente trabalho.

Ao Dr. José Eduardo Krieger pela disponibilização de toda infraestrutura do Laboratório de Genéica e Cardiologia Molecular onde foi realizado o presente estudo.

À Dra. Hiro Goto pelo empréstimo da sala localizada no Laboratório de Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina, onde está localizado nosso Biotério.

Aos companheiros de trabalho do INCOR, especialmente aos auxiliares técnicos Arruda e Jâno por toda a juda.

Aos amigos José, Ângelo e Dani por todas as discussões, companheirismo, ajuda, ensinamentos e apoio nos momentos difíceis.

À amiga Marcela Bermudes por todo o conhecimento passado, pela alegria e risadas proporcionadas em todos os momentos, muito boa sorte em sua nova empreitada.

Aos amigos de hoje e sempre, que estiveram do meu lado em todos os momentos, bons e especialmente nos ruins, sempre que precisei, fosse para ficar em casa fazendo nada, Pedrão, Feto, Pexe, Sula, Fefê, Marquito, Fafá, Flatú, muitíssimo obrigado.

Aos amigos de longe, mesmo que nos vendo apenas uma vez ao mês (quando muito), momentos em que renovava todas as energias para seguir em frente, Passa, Tio Chico, Robertinha, Bel, Simão, Jólia, Gabi, Alonso, Marina Japa, Batman, Picles, Daniel, Jaspion, vocês são mais especiais do que imaginam.

À minha namorada Laura por todo amor e companheirismo. À sua família pelo suporte e acolhimento nesse final de jornada.

À minha orientadora, Profa. Dra. Silvana Chiavegatto, pela compreensão, paciência e perseverança em todos esses anos, mesmo após inúmeros tropeços de minha parte, além de todo o conhecimento e discussões importantíssimas no decorrer deste trabalho.

E em especial aos meu pais e meu irmão, pelo apoio incondicional, paciência, puxões de orelha, palavras de incentivo, e por fornecerem toda a estrutura, física e emocional, que permitiram que eu chegasse onde cheguei.



Sumário


Agradecimentos

4

Sumário

6

Resumo

8

Summary

9

Introdução


10

1- Esteróides anabolizantes

10

2- Esteróides anabolizantes e comportamentos emocionais

16

3- Sistema serotoninérgico central e comportamentos emocionais

19

3.1- Receptores de serotonina

20

4- Esteróides anabolizantes e o sistema serotoninérgico

26

Objetivos

27

Métodos

28

1- Animais

28

2- Drogas

28

3- Delineamento experimental

28

4- Aparatos e modelos comportamentais

30

5- Preparação das amostras para PCR em Tempo Real

33

6- Determinação da concentração hormonal androgênica plasmática

37

Análise dos Resultados

38

Resultados

38

1- Aspectos Fisiológicos e Comportamentais

39

1.1- Medida do peso corpóreo dos animais ao longo do tratamento

39

1.2- Atividade motora espontânea no campo aberto

40

1.3- Comportamento no larinto em cruz elevado

41

1.4- Atividade na caixa claro-escuro

42

1.5- Imobilidade no teste de nado forçado (Porsolt)

43

1.6- Comportamento agressivo (Residente-Intruso)

44

2- Análise da Expressão Gênica Diferencial

44

2.1- Pares de primers utilizados para a amplificação dos genes

45

2.2- Genes de referência utilizados em cada estrutura encefálica

45

2.3- Expressão gênica no córtex pré-frontal

46

2.4- Expressão gênica no hipotálamo

48

2.5- Expressão gênica no hipocampo

49

2.6- Expressão gênica na amígdala

51

2.7- Expressão gênica no mesencéfalo

52

3- Determinação da concentração de compostos androgênicos plasmáticos

54

Discussão

56

1- Comportamentos emocionais

57

2- Expressão dos genes relacionados ao sistema serotoninérgico

60

2.1- Amígdala

60

2.2- Córtex pré-frontal

62

2.3- Hipocampo e Hipotálamo

63

2.4- Mesencéfalo

64

Conclusão

65

Anexo I – Parecer Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa

66

Referências bibliográficas

68

Ambar G. Efeitos da administração prolongada do esteróide anabolizante decanoato de nandrolona em comportamentos emocionais e na expressão de genes relacionados ao sistema serotoninérgico em diferentes áreas cerebrais de camundongos (dissertação). Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, SP; 2008.



O decanoato de nandrolona é um esteróide anabólico-androgênico (EAA), derivado da testosterona, utilizado de maneira abusiva por indivíduos procurando ganho de força física ou apenas efeitos estéticos. Doses suprafisiológicas desses compostos têm sido associadas a efeitos psiquiátricos adversos, especialmente episódios de impulsividade e aumento no comportamento agressivo. Considerando o desconhecimento dos mecanismos neurais envolvidos nessa desinibição comportamental, nós investigamos a integridade da transcrição de componentes do sistema serotoninérgico (intimamente relacionados à expressão de comportamentos emocionais) em diversas áreas cerebrais de camundongos sob a administração prolongada de nandrolona. Camundongos machos adultos da linhagem C57Bl/6J receberam uma injeção subcutânea diária de 15 mg/kg de decanoato de nandrolona durante 28 dias. Diferentes grupos de animais foram utilizados para a análise de comportamentos emocionais e para a quantificação da expressão de genes relacionados à serotonina (5-HT), utilizando a transcrição reversa do RNA associada à técnica de PCR em tempo-real. Os camundongos tratados apresentaram um aumento na massa corporal, hiperatividade motora e aumento de comportamentos relacionados à ansiedade em ambientes novos. A imobilidade avaliada no teste de nado forçado apresentou-se reduzida. Os animais que receberam a nandrolona se mostraram mais agressivos e impulsivos para iniciar o ataque aos camundongos oponentes, no modelo de residente-intruso. O EAA induziu uma redução significante na quantidade de transcritos da maioria dos receptores pós-sinápticos de 5-HT investigados na amígdala e no córtex pré-frontal. A expressão do gene do receptor 5-HT1B (reconhecidamente envolvido com as alterações comportamentais observadas) estava também reduzida no hipocampo e hipotálamo. No mesencéfalo, região onde se encontram os corpos neuronais dos neurônios serotoninérgicos que inervam o sistema límbico e demais áreas cerebrais, não se observou nenhuma alteração na expressão dos genes relacionados aos receptores serotoninérgicos pré-sinápticos. Os transcritos do transportador e da enzima de síntese de 5-HT, indicadores da integridade serotoninérgica pré-sináptica, também não se apresentaram alterados. Dessa maneira, concluímos que o efeito de altas doses do EAA decanoato de nandrolona em camundongos confirma os dados encontrados em literatura quanto à desinibição comportamental observada em usuários abusivos humanos. Nosso modelo também foi eficiente em mostrar pela primeira vez alterações moleculares induzidas por este EAA. A redução generalizada na expressão dos genes de receptores de 5-HT na amígdala e córtex pré-frontal sugere essas áreas, pós-sinápticas ao sistema serotoninérgico, como críticas nos efeitos induzidos pelo EAA. Nosso trabalho também sugere um papel importante para o receptor 5-HT1B na desinibição comportamental observada.
Palavras-chave: decanoato de nandrolona; agressividade; expressão gênica; sistema serotoninérgico.

Ambar G. Effects of prolonged administration of the anabolic-androgenic steroid nandrolone decanoate in emotional behaviors and serotonergic system related genes expression in several brain areas of mice (dissertation). Medicine Faculty, Sao Paulo University, SP (Brazil); 2008.


Nandrolone decanoate is a highly abused anabolic-androgenic steroid (AAS) by individuals looking for gains in physical strength or body appearance. Supraphysiological doses of this testosterone synthetic derivative have been associated with many physical and psychiatric adverse effects, especially reported episodes of impulsiveness and overt aggressive behavior. Since the neural mechanisms underlying AAS-induced behavioral disinhibition are unknown, we investigated the integrity of serotonergic system transcription in several brain areas of mice under prolonged nandrolone administration. Male C57Bl/6J mice received 15 mg/kg of nandrolone decanoate subcutaneously once daily for 28 days, and different sets of animals were used to investigate motor and emotion-related behaviors or 5-HT-related gene expression by qRT-PCR. AAS-injected mice had increased body weight, were hyperactive and displayed more anxious-like behaviors in novel environments. They exhibited reduced immobility in the forced swim test, higher probability of being aggressive and elevated impulsivity to attack the opponent. AAS induced substantial reduction in the transcription of most postsynaptic 5-HT receptors investigated in the amygdala and prefrontal cortex. Interestingly, 5-HT1B mRNA was further reduced in the hippocampus and hypothalamus. At the midbrain level, there was no alteration in 5-HT receptors, transporter or synthetic enzyme gene transcription. In conclusion, high doses of AAS nandrolone in male mice recapitulate the behavioral disinhibition observed in abusers. Furthermore, they are associated with overall decrease in 5-HT receptor gene expression in the amygdala and prefrontal cortex, implicating these areas as critical sites for AASinduced effects and indicating a role for the 5-HT1B receptor in this behavioral disinhibition.
Keywords: nandrolone decanoate; aggression; gene expression; serotonergic system.

Introdução





  1. Esteróides anabolizantes

Os hormônios esteróides são produzidos pelo córtex da supra-renal e pelas gônadas (ovário e testículo). Os esteróides anabolizantes ou esteróides anabólico-androgênicos (EAA) referem-se aos hormônios esteróides da classe dos hormônios sexuais masculinos, promotores e mantenedores das características sexuais específicas (incluindo o trato genital, as características sexuais secundárias e a fertilidade) e da condição anabólica dos tecidos somáticos (Mooradian et al., 1987). Os EAA incluem a testosterona e seus derivados. Naturalmente no organismo, a testosterona passa por uma série de biotransformações por oxiredução (Figura 1). O primeiro passo é a redução nos produtos 5- e 5-dihidrotestosterona (DHT), respectivamente pelas enzimas 5a- (cérebro e trato reprodutivo) e 5b-redutases (fígado). Enquanto os esteróides 5a são androgênicos, os 5b não são (Shahidi, 2001).


Figura 1. Biotransformação da testosterona.
Atualmente, os EAA têm sido administrados no tratamento das deficiências androgênicas, tais como: hipogonadismo, puberdade e crescimento retardados, micropênis neonatal, deficiência parcial em homens idosos e deficiência secundária por doenças crônicas, contracepção hormonal masculina, osteoporose, anemia secundária, baixa estatura devido à síndrome de Turner (Cowart, 1989; Rosenfeld et al, 1992; Schroor et al, 1995; Bhasin et al, 1997; De Rose & Nóbrega, 1999; Conway et al, 2000). No tratamento das deficiências anabólicas, têm sido utilizados nas sarcopenias relacionadas ao HIV, à cirrose alcoólica, à doença obstrutiva pulmonar crônica, e em pacientes com queimaduras graves (Grinspoon et al, 2000; Dobs, 1999); no tratamento da fadiga em pacientes com doença renal crônica e no retardo da fraqueza na distrofia muscular de Duchenne (Johansen et al, 1999; Fenichel et al, 2001). Há também relatos recentes do uso de esteróides anabólicos em baixas doses no tratamento de doenças cardiovasculares, tendo efeitos antiaterogênicos e antianginosos (English et al, 2000). O valor terapêutico da testosterona levou à síntese de muitos derivados com o intuito de prolongar a atividade biológica da molécula parental in vivo, produzir androgênios ativos orais, e desenvolver produtos que sejam menos androgênicos e mais anabólicos (Shahidi, 2001). A atividade anabólica da testosterona e de seus derivados é primeiramente manifestada na ação miotrófica, que resulta em maior massa e força muscular. Entretanto, os benefícios dos EAA em atletas continuam controversos.

Em 1990, em resposta ao problema de produção e venda ilegal de EAA, o Congresso dos EUA aprovou uma legislação fazendo dos EAA substâncias controladas nível III. Apesar da publicidade adversa, estimativas recentes reportam mais de meio milhão de adolescentes com uso freqüente de EAA nos EUA (http://www.drugabuse.gov/Infofacts/steroids.html). Dentre os EAA derivados da testosterona mais consumidos nos EUA (Tabela 1), o decanoato de nandrolona é o mais utilizado.



Tabela 1: Lista dos EAA mais consumidos nos EUA (National Institute on Drug Abuse- NIDA), 2001

No Brasil, estudos que abordam o uso de anabolizantes são escassos (Iriart & Andrade, 2002). Entretanto, levantamentos feitos pelo Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas Psicotrópicas (CEBRID), realizados no ano de 2005 nas 108 cidades brasileiras com mais de 200 mil habitantes, 0,9% da população (456.000) já utilizou esteróides anabolizantes alguma vez na vida (CEBRID, 2005). O consumidor preferencial no Brasil é representado por homens entre 17 e 34 anos (Figura 2). O maior número de usuários concentra-se na região Sudeste do país (Figura 3), e o uso, comparado com a última estimativa realizada em 2001, obteve um aumento de 206% (Figura 4). Estes números ainda são considerados baixos se comparados às demais drogas de abuso, entretanto indicam um aumento preocupante no número de usuários dessa substância no Brasil.



Figura 2. Faixa etária da população brasileira que teria consumido esteróides anabolizantes “ao menos uma vez na vida” segundo estimativas do CEBRID realizadas em 2005 nas 108 cidades brasileiras com mais de 200 mil habitantes.






Figura 3. Estimativa da porcentagem da população brasileira que teria usado esteróides anabolizantes “ao menos uma vez na vida” por região geográfica, realizada pelo CEBRID em 2005 levando em conta as 108 cidades brasileiras com mais de 200 mil habitantes.



Figura 4. Comparativo entre as estimativas do CEBRID realizadas em 2001 e 2005 quanto a percentagem da população brasileira que teria usado esteróides anabolizantes “ao menos uma vez na vida”.

Não existem informações sobre os EAA mais utilizados no Brasil, entretanto, é grande o número de compostos encontrados no mercado nacional (Tabela 2).


Tabela 2: Lista das substâncias anabolizantes disponíveis atualmente no mercado brasileiro segundo a Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Junho de 2008)


Substâncias anabolizantes sujeitas a controle especial




1. ANDROSTANOLONA

2. BOLASTERONA

3. BOLDENONA

4. CLOROXOMESTERONA

5. CLOSTEBOL

6. DEIDROCLORMETILTESTOSTERONA

7. DROSTANOLONA

8. ESTANOLONA

9. ESTANOZOLOL

10. ETILESTRENOL

11. FLUOXIMESTERONA OU FLUOXIMETILTESTOSTERONA

12. FORMEBOLONA

13. MESTEROLONA

14. METANDIENONA



15. METANDRANONA

16. METANDRIOL

17. METENOLONA

18. METILTESTOSTERONA

19. MIBOLERONA

20. NANDROLONA

21. NORETANDROLONA

22. OXANDROLONA

23. OXIMESTERONA

24. OXIMETOLONA

25. PRASTERONA (DEIDROPIANDROSTERONA - DHEA)

26. SOMATROPINA (HORMÔNIO DO CRESCIMENTO HUMANO)

27. TESTOSTERONA

28. TREMBOLONA












O decanoato de nandrolona também possui os derivados 5a, 5b e pode ser aromatizado, porém, é mais anabólico e menos androgênico que a testosterona (Engel et al, 1987). Como a própria testosterona, ele pode ser aromatizado em 17β-estradiol, e assim apresentar um efeito adicional e significativo sobre o sistema nervoso central, agindo sobre os receptores androgênicos na sua forma natural e sobre os estrogênicos através dos metabólitos de sua forma estrogênica (Clark et al. 2003).

Os efeitos estimulantes dos andrógenos no cérebro – que freqüentemente resultam em um sentimento de euforia e agressividade crescentes– associados ao resultado muscular, têm proliferado o uso de EAA por atletas de todos os níveis, assim como por usuários de outras drogas de abuso. O uso dos EAA se dá basicamente de três maneiras:


  1. “ciclo”: que se refere a qualquer período de utilização de tempos em tempos, variando de quatro a dezoito semanas;

  2. “pirâmide”: pequenas doses que vão aumentando gradualmente até o ápice, e logo em seguida reduzindo gradualmente até o final do período;

  3. stacking”: (uso alternado de acordo com a toxicidade), que consiste em vários esteróides utilizados ao mesmo tempo.

É comum a mistura dos três métodos, e geralmente os EAA são administrados em doses suprafisiólogicas (que caracteriza o uso abusivo), podendo chegar a 500mg ou mais por dia, consumidas por várias semanas ou meses (Wu, 1997; Catlin, 2001).



  1. Esteróides anabolizantes e comportamentos emocionais

O uso abusivo de EAA é baseado em doses suprafisiológicas que são de 10 a 100 vezes maiores que as doses terapêuticas (Brower, 1993; Clark & Fast, 1996), e isso tem sido associado a um amplo espectro de efeitos adversos físicos e psíquicos. Pouco se sabe sobre a atuação dos EAA no cérebro humano, havendo relatos de alterações no comportamento agressivo, ansiedade e depressão (Pope & Katz, 1988; Bahrke et al., 1990; Schulte et al., 1993).

Uma série de estudos sugere que os esteróides podem causar sintomas hipomaníacos ou maníacos, incluindo particularmente comportamento agressivo ou violento em alguns indivíduos (Pope et al, 1996). Alguns trabalhos clássicos sugerem um aumento no comportamento típico de depressão ou humor disfórico com o uso dos EAA (Lefavi et al, 1990; Perry et al, 1990; Su et al, 1993), sendo esse aumento considerado de severidade insuficiente para ser considerado um transtorno psiquiátrico (Perry et al, 1990). Contudo, outros trabalhos não encontraram relação entre o uso da droga e depressão ou níveis de tensão/ansiedade (Bahrke et al, 1992; Choi et al, 1990). As alterações emocionais não podem ser explicadas apenas pelos efeitos do halterofilismo e pela cultura das academias de ginástica, ou ainda pela personalidade dos usuários, pois estes sintomas não são encontrados nos não usuários com históricos atléticos semelhantes ou nos próprios usuários durante os intervalos em que não estão tomando as drogas (Pope & Katz, 1988; Choi et al, 1990; Lefavi et al, 1990; Perry et al, 1990; Burnett & Kleiman, 1994; Pope & Katz, 1994). O comportamento agressivo é um dos mais afetados pelo abuso de esteróides (Midgley et al., 2001), inclusive podendo levar a crimes violentos (Conacher & Workman, 1989).

Com relação aos mecanismos celulares e moleculares dos hormônios esteróides, vale lembrar que os efeitos obtidos em curto prazo parecem ser devido a modulações alostéricas ou ações pós-traducionais na membrana celular (Clark e col. em 2003). Entretanto, os efeitos que só são evidentes após a administração prolongada dos EAA implicam em alterações na expressão gênica, mediadas pela ação de receptores androgênicos e estrogênicos no cérebro. Os hormônios esteróides atuam em proteínas receptoras intracelulares, e após a ligação do hormônio ao receptor ocorre uma translocação desse complexo para o núcleo celular e então para sítios de ligação na cromatina, através dos quais modulam a transcrição gênica e subseqüente síntese de RNA mensageiro (RNAm). Efeitos diferenciais dos EAA são observados dependendo do local e tipo celular em que estão atuando (Spelsberg et al., 1989).

Estudos recentes estão começando a investigar mecanismos moleculares cerebrais relacionados aos efeitos comportamentais de altas doses de EAA em roedores. O uso crônico de EAA em camundongos mostrou-se indutor de mudanças dependentes de dose, sexo e idade na expressão gênica da subunidade do receptor GABAA em áreas cerebrais anteriores (McIntyre et al., 2002; reviewed in Clark et al., 2006) sugerindo o envolvimento do sistema inibitório GABAérgico. O envolvimento glutamatérgico foi recentemente demonstrado em hamsters adolescentes tratados com EAA pelo aumento nos neurônios que expressam glutamato e na expressão do receptor GluR1 em áreas específicas de agressividade (Fischer et al., 2007).

Roedores recebendo injeções de EAA em doses suprafisiológicas (> 3 mg/kg/day, Clark & Fast, 1986; Clark & Henderson, 2003) mostraram aumento na agressão social (Breuer et al, 2001; Harrison et al, 2000), sendo os efeitos freqüentemente dependentes da espécie e linhagem do animal, bem como do tipo de EAA administrado (Clark & Henderson, 2003). Hamsters tratados com decanoato de nandrolona durante seu período de desenvolvimento apresentaram aumento do receptor V1A em estudos de ligação (estudos debinding”) e na densidade de fibras imunorreativas de arginina vasopressina no hipotálamo anterior e em áreas cerebrais relacionadas à agressividade (Harrison et al., 2000; De Leon et al, 2002).

Camundongos tratados com a mesma droga cronicamente apresentaram diminuição na quantidade de RNAm do receptor dopaminérgico D1 nos núcleos caudado-putâmen e núcleo acumbens (Kindlundh et al, 2001; Kindlundh et al, 2003), receptor também implicado à modulação do comportamento agressivo (Volavka et al, 2004). Outros estudos tentam correlacionar as alterações comportamentais aos efeitos dos EAA nas neurotransmissões centrais serotoninérgicas, gabaérgicas, entre outras, em diversas áreas do cérebro (Thiblin et al, 1999; Hallberg et al, 2000; Yang, 2002).



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