História dos métodos de diagnóstico para a doença de Chagas



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História dos métodos de diagnóstico para a doença de Chagas


 Alejandro Luquetti Ostermayer

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia, GO, Brasil

E-mail: luquetti@hc.ufg.br

 

O diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi, agente causal da doença de Chagas, como em outras enfermidades infecciosas, tem como base três parâmetros distintos: as manifestações clínicas que, se presentes, permitem ao médico suspeitar da infecção; os antecedentes epidemiológicos, que também induzem o clínico à suspeita; e os métodos de diagnóstico, em geral laboratoriais, que permitem confirmar ou excluir a suspeita diagnóstica na maioria das situações. Caberá ao clínico, de posse das informações acima, decidir se o indivíduo é infectado ou não. Cabe assinalar que infecção por certo agente não é sinônimo de doença; haja vista que muitas infecções transcorrem sem doença clinicamente ostensiva. Na infecção peloT. cruzi, lembramos que mais da metade dos infectados não apresenta cardiopatia, nem megaesôfago nem megacólon, as principais manifestações da doença de Chagas. Nestes casos em particular, o diagnóstico é sugerido pelos antecedentes epidemiológicos e confirmado ou excluído pelos resultados dos exames laboratoriais.

Pelo exposto, os métodos de diagnóstico adquirem particular importância na doença de Chagas. Acresce que esta infecção apresenta-se apenas em duas fases distintas quanto à cronologia da infecção, às manifestações clínicas e aos métodos de diagnóstico. A fase aguda, inicial, com febre e sintomas inespecíficos (às vezes com sinal de Romaña ou chagoma de inoculação) se diagnostica por métodos parasitológicos em decorrência da elevada parasitemia que define esta fase. A fase crônica tem o seu início após a fase aguda e que, como assinalado, é assintomática em mais da metade dos casos, o diagnóstico laboratorial baseia-se na pesquisa indireta de sinais da infecção, ou seja, a presença de anticorpos anti-T. cruzi.

A história dos métodos de diagnóstico pode ser dividida em três períodos, de diferente duração. O primeiro período, desde a descoberta até 1960, é comentado a seguir:

Os primeiros métodos desenvolvidos foram os parasitológicos. Carlos Chagas baseou-se no achado do T. cruzi na criança Berenice, para afirmar que este agente era o responsável do quadro clínico. Tratava-se de fase aguda da doença, e o diagnóstico, hoje em dia, 97 anos após, continua sendo realizado da mesma forma, com a pesquisa direta do T. cruzi no sangue periférico.

Na fase crônica da tripanossomíase, nos primeiros anos após a sua descoberta, o diagnóstico de laboratório era feito por inoculação do sangue dos pacientes em cobaias. Chagas descreveu a presença de formas parasitárias esquizogônicas no pulmão das cobaias infectadas, que julgou fossem do T. cruzi. Este achado passou a constituir um método diagnóstico na infecção experimental da cobaia até 1913, quando se demonstrou que se tratava, na verdade, de outro parasito, o Pneumocystis carini, e o método foi abandonado.

Em 1914, Brumpt descreveu outra modalidade de diagnóstico parasitológico, oxenodiagnóstico, que inicialmente foi pouco utilizado. As primeiras referências ao seu emprego no diagnóstico da doença de Chagas são de Torrealba, na Venezuela em 1934; de Emmanuel Dias, no Brasil e Bacigalupo, na Argentina. O método só passou a ser utilizado rotineiramente após sua padronização por Cerisola e colaboradores em 1974.

A primeira descrição de pesquisa de anticorpos data de 1913 e deve-se a Guerreiro e Machado. Tratava-se da reação de fixação de complemento, logo conhecida como a reação de Guerreiro e Machado, que foi o único teste sorológico disponível durante mais de 50 anos, e que foi realizado de rotina para o diagnóstico até recentemente. Este teste sofreu múltiplas modificações e padronizações, destacando-se a contribuição de Almeida e Fife em 1976. A complexidade técnica, a utilização de vários reagentes que demandam padronização diária e o tempo de reação levaram ao seu abandono a partir de 1995, principalmente pela existência de testes mais simples. Nessa época, um parecer técnico do Ministério da Saúde recomendou a sua substituição por outros testes. Neste primeiro período na evolução do conhecimento do diagnóstico, até 1960, contava-se apenas com dois testes por mais de 50 anos.

O segundo período, de 1960 a 1975, foi de grande desenvolvimento, como será relatado a seguir:

O hemocultivo, introduzido como método diagnóstico parasitológico desde a década de 1940, apresentava resultados bem inferiores ao xenodiagnóstico, não sendo por isso utilizado. Após os trabalhos de Chiari e Brener em 1966 com sucessivos aperfeiçoamentos voltou a ser empregado até os dias de hoje com resultados comparáveis aos do xenodiagnóstico e a vantagem de permitir o isolamento do parasito.

A inoculação em animais experimentais também foi utilizada desde longa data, porém deixou de ser empregada como método de diagnóstico devido às dificuldades operacionais, assim como a sua baixa sensibilidade na fase crônica.

Outros testes foram utilizados, tais como a detecção de antígeno circulante, antigenúria, testes de hipersensibilidade tardia, porém não foram incorporados à rotina e não são utilizados.

Inúmeras tentativas de utilização de testes sorológicos empregando outros métodos: testes de precipitação, de aglutinação de látex, de floculação, não frutificaram, ora pela baixa eficiência ora pelos custos elevados.

Em 1962, Cerisola e colaboradores descrevem a utilização do teste de hemaglutinação indireta (HAI) para o diagnóstico sorológico da infecção. Este teste, de fácil execução e bom desempenho é utilizado até hoje, embora apresente sensibilidade menor que os testes de imunofluorescência e de ELISA. Por esta razão, não é recomendado para exclusão de doadores de sangue.

Pouco tempo depois (1966) Camargo otimiza a utilização do teste de imunofluorescência indireta, já descrito por Fife e Muschel. Este teste, de elevada sensibilidade, foi utilizado no inquérito nacional sorológico, com mais de um milhão de amostras em todo o Brasil, que determinou, com bastante precisão, a prevalência da doença. Dada a sua elevada sensibilidade, é ideal para estudos epidemiológicos, assim como para diagnóstico, embora apresente reações cruzadas, em particular com leishmanioses. O mesmo continua a ser usado até o presente, simultaneamente com a HAI e a ELISA, constituindo os três os chamados de testes convencionais, com os quais há grande experiência em todos os países da América Latina.

O teste de aglutinação direta, aperfeiçoado por Vattuone e Yanovsy com a inclusão sistemática do agente redutor 2 mercapto-etanol, foi utilizado principalmente na Argentina  com bons resultados, porém a sua comercialização foi interrompida.

Em 1975, Voller e colaboradores descrevem o teste imunoenzimático de ELISA em amostras de papel-filtro, método que foi aperfeiçoado e é atualmente utilizado na rotina diagnóstica dos serviços de hemoterapia e de diagnóstico, existindo no Brasil doze marcas aprovadas pela Anvisa, com bom desempenho.

No terceiro período, de 1976 até o presente, a biologia molecular aprimorou os métodos existentes e desenvolveu outros. Em sucessivos estudos, procurou-se melhorar a qualidade dos antígenos até então utilizados, extratos totais (antígeno bruto) do parasito por antígenos purificados por diversos procedimentos - na tentativa de evitar reações cruzadas, observadas com os testes convencionais de diagnóstico. Assim, na década de 1980, foram publicados trabalhos empregando glicoproteínas de 25 kDa (26), 90 kDa (27) e de 72 kDa entre outras, com painéis de soros de pacientes com as diferentes formas clínicas da doença. Esses reagentes ainda não se encontram comercializados.

Com o avanço no conhecimento da biologia molecular, a partir de 1980 foram isoladas proteínas recombinantes por diversos grupos no Brasil, Argentina e Estados Unidos, obtendo-se bons resultados de acordo com cada grupo. Também foram publicados estudos com peptídeos sintéticos, como revisto por Silveira e colaboradores. Para elucidar quais teriam maior aplicabilidade, o programa TDR (Tropical Diseases Research) da Organização Mundial da Saúde promoveu um estudo multicêntrico que incluiu também alguns dos antígenos purificados. Esse estudo definiu alguns deles como apropriados. Outro estudo confirmou alguns desses resultados assim como um terceiro, com maior número de soros.

Após esses estudos foram desenvolvidos vários testes rápidos, alguns deles com a intenção de verificar o diagnóstico no campo, com apenas uma gota de sangue. Um desses testes foi validado em estudo multicêntrico.

Em outra fase do diagnóstico laboratorial, na década de 1990, os estudos dirigiram-se para a amplificação de ácidos nucléicos do próprio parasito, visando ao diagnóstico parasitológico, pela amplificação por PCR. Hoje em dia, é possível verificar a presença de um parasito em 20 mL de sangue. Ocorre que, por ser um método de verificação da presença do parasito, que pode não estar presente no infectado crônico, um resultado negativo não tem valor diagnóstico. A sensibilidade é superior a do hemocultivo e do xenodiagnóstico, embora exista preocupação quanto à especificidade quando realizado em serviços de rotina. Acresce que não se encontra ainda comercializado.

Embora contando com vários testes sorológicos de bom desempenho, é necessário que os mesmos sejam verificados, lote a lote, e que os laboratórios mantenham pessoal com instruções técnicas apropriadas. O Ministério da Saúde do Brasil tem demonstrado sensibilidade a este respeito, promovendo estudos dos reagentes comercializados. De parceria com a Gerência de AIDS, elaborou um manual e vídeo (Telelab) sobre o diagnóstico da doença. Ainda em parceria com Biomanguinhos, a Anvisa desenvolve programa de qualidade externo, desde 2001, que se encontra na 13ª avaliação, para os serviços de hemoterapia do Brasil.


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