Ii workshop em Novos Bioativos de Macroalgas



Baixar 50.22 Kb.
Encontro04.08.2016
Tamanho50.22 Kb.
II Workshop em Novos Bioativos de Macroalgas:
Manejo e Cultivo, Conservação, Biotecnologia e Técnicas de Bioatividade

26 a 29 de julho de 2009 - Ilha Flat Hotel, Ilhabela, São Paulo

MINICURSO:

MEDIDAS DE FOTOSSÍNTESE
TEORIA E PRÁTICA NA FISIOLOGIA DE MACROALGAS


APOSTILA: noções teóricas e práticas

  • bioquímica da fotossíntese

  • DIVING-PAM

RESPONSÁVEIS PELO CURSO

Aline Martins (IQ-USP)

Dinaelza Pereira (IQ-USP)

João Almeida (IQ-USP)

Marcella Carneiro (IB-USP)

ESTRUTURA DO CURSO


  • princípios básicos da bioquímica da fotossíntese;

  • apresentação do analisador submersível de rendimento fotossintético DIVING-PAM;

  • atividade prática:

    • DIVING-PAM;

    • determinação de parâmetros fotossintéticos de macroalgas.


BIOQUÍMICA DA FOTOSSÍNTESE

A fotossíntese é a rota pela qual quase toda a energia entra na biosfera. Este processo realiza a transformação de energia luminosa, emitida pelo sol, em energia química, que é estocada pelos organismos fotossintetizantes autotróficos na forma de glicose (6 carbonos). A energia armazenada nessas moléculas pode ser utilizada mais tarde para impulsionar processos celulares na planta e servir como fonte de energia para todas as formas de vida.

Durante a fotossíntese, a planta utiliza a energia solar para oxidar a água, liberando oxigênio (O2), e para reduzir o dióxido de carbono (CO2), produzindo grandes compostos carbonados, sendo que esse processo atua fortemente na ciclagem desses elementos químicos.

O processo fotossintético ocorre em organelas especiais, chamadas de cloroplastos. Essas organelas possuem membrana dupla, à semelhança do que é observado em mitocôndrias. A membrana externa é pouco seletiva à passagem de solutos, enquanto a interna é bastante seletiva a essa passagem.

A porção interior dos cloroplastos (como um “citoplasma” dos cloroplastos) é chamada de estroma. No estroma pode-se encontrar a membrana tilacóide, uma membrana biológica que separa duas porções: uma externa, que nada mais é do que o estroma citado anteriormente, e uma interna, chamada de lúmen do tilacóide. Assim, estroma e lúmen ficam isolados um do outro. Esse isolamento, que pode ser qualificado como físico-químico, é fundamental para o funcionamento da fotossíntese.

A membrana tilacóide é a estrutura dos cloroplastos que contém os pigmentos fotossintetizantes, responsáveis pela absorção da energia luminosa. Desse modo, é o local de ocorrência da chamada etapa “clara” ou reações luminosas da fotossíntese. Já o estroma contém o aparato bioquímico necessário para a assimilação de CO2, processo chamado de etapa “escura” ou reações de carboxilação da fotossíntese.

Os próximos parágrafos procurarão elucidar melhor essas duas etapas da fotossíntese.
REAÇÕES LUMINOSAS

É a etapa na qual ocorre a formação de compostos de alta energia, como ATP e NADPH, a partir da utilização da energia luminosa.

A energia luminosa é convertida em energia química por meio de unidades funcionais, localizadas na membrana do tilacóide, chamadas de fotossistemas.

Os fotossistemas são constituídos por cerca de 200 a 400 moléculas de pigmentos associadas à proteínas e possuem dois componentes intimamente ligados: um complexo do centro de reação e um complexo antena.

Os pigmentos acessórios como as clorofilas a, b, c e d, os carotenóides e as ficobiliproteínas fazem parte do complexo antena e tem como função principal absorver os fótons e transferir a energia para o complexo do centro de reação, onde as moléculas de clorofila a são excitadas e seus elétrons são transferidos para uma molécula aceptora de elétrons. Existem dois tipos de fotossistemas, que trabalham de forma simultânea e contínua: o fotossistema I (PSI), no qual as moléculas de clorofila a do centro de reação (P700) possuem pico ótimo de absorção em 700 nm e o fotossistema II (PSII), no qual as moléculas de clorofila a do centro de reação (P680) possuem o pico máximo de absorção em 680 nm.
Fluxo de elétrons e fotofosforilação

O fluxo contínuo de elétrons da água para o PSII, deste para o PSI e para o NADP+ é chamado de fluxo não-cíclico de elétrons, e a produção de ATP que ocorre durante esse processo é denominada fotofosforilação não-cíclica. Entretanto, o PSI pode trabalhar independentemente do PSII, sendo esse processo denomindado de fluxo cíclico de elétrons, e a produção de ATP denominada fotofosforilação cíclica. A seguir, serão elucidados esses dois processos.


- Fluxo não-cíclico de elétrons e fotofosforilação não-cíclica:

Os fótons excitam os centros de reação dos fotossistemas II e I e um elétron é transferido para um nível superior de energia. O elétron passa, então, por uma série de carreadores e reduz o P700 (para os elétrons vindos do PSII) ou o NADP+ (para os elétrons vindos do PSI). O fotossistema II oxida a água a O2, reduzindo assim o P680.

A oxidação da água pelo PSII e o transporte de elétrons do PSII para o PSI resultam na liberação de prótons no lume do tilacóide, enquanto que a redução do NADP+ a NADPH consome prótons do estroma, gerando um gradiente eletroquímico com alta concentração de prótons no lume do tilacóide e baixa concentração no estroma. Os prótons presentes no lume se difundem até a ATP sintase (presente na membrana do tilacóide) e a sua difusão a favor do gradiente de potencial eletroquímico acarreta na fotofosforilação do ADP pela ATP sintase, impulsionando a síntese de ATP no estroma. O NADPH e o ATP formados durante as reações luminosas fornecem energia para a redução do carbono.
- Fluxo cíclico de elétrons e fotofosforilação cíclica:

Nesse processo, os elétrons são impulsionados do P700 para uma ferredoxina e, ao invés de serem utilizados para reduzir o NADP+, eles são transportados para um intermediário do PSII, retornando ao centro de reação do PSI. Este fluxo cíclico está acoplado ao bombeamento de prótons para o lume, os quais são utilizados para a síntese de ATP, mas não oxida água ou reduz NADP+.



REAÇÕES DE CARBOXILAÇÃO

A etapa “escura” da fotossíntese, também chamada de ciclo de Calvin, é aquela na qual ocorre síntese de açúcares monossacarídeos a partir da fixação de CO2. Configura-se como um ciclo na medida em que o substrato inicial da via, ribulose 1,5-bisfosfato, é regenerado no final da mesma.

Vale destacar a 1ª reação do ciclo, aquela que é catalisada pela ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase/oxidase (Rubisco), a qual promove a incorporação de 1 átomo de carbono, oriundo de uma molécula de CO2, a um substrato de 5 carbonos, a ribulose 1,5-bisfosfato.

A produção de 1 molécula de glicose (que possui 6 carbonos), requer: 6 moléculas de 5 carbonos (5 moléculas de ribulose 1,5-bisfosfato), 6 moléculas de CO2, 18 ATP e 12 NADPH. Os NADPH e os ATP consumidos podem ser oriundos tanto da fase “clara” da fotossíntese quanto de reações de oxidação de compostos orgânicos (glicólise, ciclo de Lynnen, ciclo de Krebs, outras) e fosforilação oxidativa. Essa situação pode ser observada na equação geral do ciclo de Calvin:


6 CO2 + 11 H2O + 18 ATP + 12 NADPH à 1 glicose 6-fosfato + 18 ADP + 17 Pi + 12 NADP+
A denominação etapa “escura” dada a esta fase da fotossíntese é imprópria, uma vez que esta etapa também depende de energia luminosa. O transporte de elétrons da fase “clara”, que só ocorre durante a iluminação de um organismo fotossintetizante, ativa indiretamente a chamada fase “escura”.

A rubisco, localizada no estroma do cloroplasto, torna-se ativa apenas em situação de valor elevado de pH (condição alcalina) associada à elevadas concentrações do cátion Mg2+. No estroma, esse cenário só é efetivamente atingido quando a fase “clara” da fotossíntese está funcionando.

Outras enzimas da etapa “escura”, também localizadas no estroma, como frutose 1,6-bisfosfatase, sedoeptulose 1,7-bisfosfatase, ribulose 5-fosfato quinase, além de dependerem das mesmas condições descritas para rubisco, também dependem dos elétrons oriundos da foto-oxidação do fotossistema I (PS I) para exibirem atividade. Via tiorredoxina, esses elétrons mantêm os grupamentos tiol (-SH) destas enzimas no estado reduzido e ativo.


DIVING-PAM
Informações Gerais

O analisador submersível de rendimento fotossintético Diving-PAM é um fluorímetro que realiza quantificação do sinal da fluorescência dos elétrons da clorofila a do fotossistema II (PS II). Esse par de elétrons é chamado de par especial, e está localizado no centro de reação do PS II.

É fundamentalmente a partir destes valores de fluorescência que os demais parâmetros fotossintéticos são determinados. Assim, efetivamente, apenas as reações luminosas da fotossíntese (fase “clara”), mais especificamente o PS II, é que são avaliadas pelo equipamento.

Um exemplo de parâmetro fotossintético bastante expressivo que pode ser determinado pelo PAM é o rendimento da conversão da energia luminosa em energia química, que ocorre durante a fotossíntese. Este rendimento, chamado de rendimento quântico (RQ), pode ser de duas categorias: efetivo (RQE), caso o organismo fotossintético tenha permanecido em condição de iluminação antes da análise; e potencial (RQP), caso o organismo tenha sido aclimatado ao escuro.

O Diving-PAM realiza avaliações do desempenho fotossintético de maneira rápida, confiável e pouco invasiva. É ideal para atividades de campo, uma vez que o princípio de aplicação de pulso de luz com amplitude modulada (PAM) permite tolerar uma razão de sinal de 1:105 entre a fluorescência da amostra e o ruído do ambiente. Suporta ser mergulhado (por isso a designação “Diving”) até 50 metros de profundidade.

Com o princípio PAM, durante a aplicação de pulsos de luz saturante (SP), a iluminação incidente no organismo analisado é aplicada em frequência, o que permite ao detector do fluorímetro diferenciar o sinal da fluorescência da clorofila do sinal de luz do ambiente. Assim, os parâmetros fotossintéticos podem ser determinados com alta reprodutibilidade e confiabilidade, mesmo quando consideramos análises feitas em campo.

Basicamente, a energia luminosa que é absorvida pelos fotossistemas pode seguir por 3 diferentes vias: via fotoquímica: que pode ser entendida como a transferência da energia dos fótons da luz, chamada de quantum (plural: quanta), em transporte de elétrons da fase “clara” da fotossíntese; via não-fotoquímica, que é a perda de parte da energia absorvida na forma de calor; e fluorescência, que é a capacidade que os elétrons do par especial possuem de excitar-se ao receberem a energia trazida pela luz. Durante a fluorescência, os elétrons absorvem energia, excitando-se, e, em seguida, retornam ao estado fundamental (de maior estabilidade) ao emitirem a energia absorvida na forma de luz de menor frequência e maior comprimento de onda.

A aplicação do SP suprime a zero a dispersão da energia luminosa pela via fotoquímica. Além disso, como o SP é muito curto (pouquíssimos segundos), ele não permite que haja variação da dispersão da energia por calor (via não-fotoquímica não varia). Ainda, o SP, como configura-se como luz contendo energia em excesso, culmina por induzir máximo rendimento da fluorescência (Fm). Das 3 diferentes vias que a luz absorvida pode seguir, apenas a fluorescência permanece possível durante o SP. É a única variável que resta, justamente aquela que é analisada pelo PAM.



Operação Básica

A operação do equipamento é bastante fácil. Ele é constituído de uma tela de cristal líquido e de um teclado foto-sensível com 8 teclas. Após a execução de qualquer função, todos os dados gerados são armazenados na memória. Em seguida, os dados podem ser transferidos a um computador para análises necessárias.


Condições para uma Boa Análise

Para a realização de leituras confiáveis sobre o desempenho fotossintético de organismos fotossintetizantes, faz-se necessária a padronização de todos os parâmetros de iluminação do equipamento às características do modelo investigado.

Além disso, sugere-se que a distância entre a amostra e o cabo de fibra óptica seja de aproximadamente de 10 mm. Durante as leituras, a disposição entre o cabo e a amostra também não pode variar.

O ajuste da função auto-zero evita que a iluminação do ambiente seja contabilizada junto à luz proveniente da fotossíntese do organismo analisado.

As medições de rendimento quântico (RQ) só fazem sentido se as condições de iluminação forem bem controladas. Para isso, duas condições fazem-se obrigatórias: 1 - a tomada de dados deve ser feita em condição “steady-state”, isto é, a condição na qual a dissipação de energia pelas vias fotoquímica, não-fotoquímica e fluorescente é constante. Em média, uma condição de iluminação constante por 15 ou 20 min. é suficiente para a obtenção do “steady-state” em plantas terrestres; 2 - iluminação do ambiente abaixo da condição de saturação da fotossíntese do organismo investigado.

Independentemente do tipo de análise realizada, as variáveis temperatura e intensidade luminosa do ponto de amostragem devem ser registradas. Ambas têm forte influência sobre o desempenho do aparato fotossintético. Em campo, o local de coleta de dados sobre fluorescência deve ser o mesmo local de coleta de dados sobre intensidade luminosa, o que pode ser realizado pelo fotômetro que acompanha o fluorímetro de fábrica.



Dinâmica da Fluorescência

A figura abaixo representa um perfil clássico da fluorescência dos elétrons da clorofila a. Os parâmetros da figura estão descriminados a seguir:











PARÂMETROS DERIVADOS DA FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA
Os parâmetros derivados da fluorêscencia da clorofila podem ser divididos em dois grupos: i. parâmetros de dissipação fotoquímica, que descrevem processos relacionados a dissipação da energia pela via fotoquímica; ii. parâmetros de dissipação não-fotoquímica, que descrevem processos relacionados a dissipação de energia pelo calor e processos de fotoproteção e danos causados pela luz.

A seguir, esses parâmetros serão apresentados. Também serão apresentadas duas funções do Diving-PAM muito utilizadas.


Dissipação fotoquímica:

  1. Rendimento quântico potencial (RQP):

Descrição: A eficiência máxima do PSII pode ser observada após a adaptação da planta no escuro, quando todos os centros de reação estão abertos (todos os aceptores primários estão oxidados) e a dissipação por calor é mínima.

É um sensível indicador da performance fotossintética da planta e mudanças em seus valores (diminuição) são resultados da dissipação da energia por calor e por efeitos da fotoinibição.

Equação: Fv/Fm

Função no Diving-PAM: Start




  1. Rendimento quântico efetivo (RQE):

Descrição: É o parâmetro mais utilizado, que mede a proporção de luz absorvida pela clorofila associada ao PSII que é usada na fotoquímica. Uma vez que não há adaptação da planta ao escuro, é possível obter a performance fotossintética real que a planta apresenta no momento da medida. Esse parâmetro deve ser avaliado em condição “steady-state” e com iluminação abaixo da condição de saturação.

Equação: ΔF/Fm’

Função no Diving-PAM: Start


  1. Extinção fotoquímica (qP):

Descrição: Mede a proporção de centros de reação do PSII que estão abertos. Alterações no valores de qP indicam o fechamento dos centros de reação, resultante da saturação da fotossíntese pela luz.

Equação: ΔF/Fm’ – F0’

Função no Diving-PAM: Start


  1. Taxa de transporte de elétrons (ETR):

Descrição: Parâmetro derivado do RQE, que meda a taxa de transporte de elétrons entre o PSII e PSI, dando uma indicação da fotossíntese global.

Equação: ΔF/ Fm’ x PAR x coef. de absorção x 0,5, onde:

ΔF/ Fm’ = RQE; PAR = luz actínica (μmol fótons m-2 s-1) = fluxo de fótons fotossinteticamente ativo (FFFA); Coeficiente de absorção = % de quanta absorvida pela planta; 0,5 = fator que explica a divisão de energia entre PSII e PSI.

Função no Diving-PAM: Start


Dissipação não-fotoquímica:

  1. NPQ

Descrição: Mudanças nos valores de NPQ medem mudanças na eficiência da dissipação do excesso de energia por calor, relativo ao estado de uma planta adaptada ao escuro. Esse parâmetro pode ser associado aos processos de fotoproteção e fotoinibição.

Equação: ΔF (Fm – Fm’) / Fm’

Função no Diving-PAM: Start
Outras funções do equipamento:


  1. Curvas de luz – Irradiância X Fotossíntese

Descrição: As amostras são submetidas a 8 irradiâncias crescentes, por períodos que variam de 10s a 3 min, e o RQE e a ETR são coletados em cada ponto de luz. Os dados obtidos dessa análise fornecem informações de como a planta consegue adaptar o aparato fotossintético à rapidas mudanças na intensidade luminosa. Além disso, a análise da curva de luz fornece informações sobre saturação e inibição da fotossíntese.

Parâmetros derivados da curva de luz: alfa (eficiência fotossintética), Ik (irradiância de saturação), Pmax (fotossíntese máxima) e beta (fotoinibição).

Equação de Platt (com fotoinibição): P=Ps(1-e^(-alfa*E/Ps))*e^(-beta*E/Ps)

Pmax=Ps*(alfa/(alfa+beta))*(beta/(beta+alfa))^(beta/alfa)

 Fórmula de Webb (sem fotoinibição): P=Pmax*(1-e^(-alfa*E/Pmax))
Função no Diving-PAM: 17


  1. Curvas de indução e recuperação

Descrição: As amostras adaptadas ao escuro são submetidas a um pulso de saturação, para obter o valor de RQP e, em seguida, a luz actínica é ligada e são aplicados 13 pulsos adicionais, a intervalos de 15s, para determinar o RQE (1). Após o desligamento da luz actínica, são dados 6 pulsos saturantes adicionais, em intervalos de 10s, 30s,1min, 2min, 5min e 10min (2).

  1. Fornece informações sobre enzimas do ciclo de Calvin, que são ativadas durante os primeiros minutos de iluminação.

  2. São obtidas informações de reações pós-iluminação, como a extinção da fotoinibição.

Função no Diving-PAM: 22
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MAXWELL, K. & JOHNSON, N. 2000. Chlorophyll Fluorescence – A Pratical Guide. Journal of Experimental Botany. 354: 659-668.

NELSON, D.L. & COX, M.M. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. 4ed. New York: W. H. Freeman.

TAIZ, L. & ZEIGER, E. 2004. Fisiologia Vegetal. 3 ed. São Paulo: Artmed Editora.

TORRES, B.B. & MARZZOCO, A. 2007. Bioquímica Básica. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.

Underwater Fluorometer DIVING-PAM. 1998. Handbook of Operation. Heins Walz GmbH.



AGRADECIMENTOS
Agradecemos a todas as pessoas que colaboraram, direta ou indiretamente, com o desenvolvimento desse minicurso, em especial ao Prof. Dr. Orlando Necchi Junior, da UNESP de São José do Rio Preto, à MSc. Anna Isabel Bautista e ao MSc. José Bononi Barufi.


©principo.org 2016
enviar mensagem

    Página principal