Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo



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Encontro06.08.2016
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Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay).

Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno. Trata-se de um método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).

No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade.

Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE. Nesse método, o anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no well. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de antígeno presente. Logo, permite mensurar até pequenas quantidades de antígeno.




Quanto ao método de revelação, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo, enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo.



O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à enzima ligam-se aos anticorpos humanos, propiciando a reação enzimática com mudança de cor.



EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:


  • PLACA DE ELISA




  • PIPETAS AUTOMÁTICAS












  • LAVADOR AUTOMÁTICO DE PLACAS




CUIDADOS:

  • Data de validade e estocagem dos REAGENTES

  • Processamento e estocagem das AMOSTRAS

  • Evitar contaminação e espuma no PREPARO DE SOLUÇÕES

  • CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos

  • LIMPEZA



PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:



  • Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o primeiro anticorpo com concentração conhecida e suficiente para adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. Em geral, a solução é saturada.

  • Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.

  • Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na placa (sítios inespecíficos).




  • Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO da placa está cumprida.

  • Incubação com as amostras (soluções teste com antígenos em concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)

  • Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo previamente aderido à placa também permanecerá aderido. Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.

  • Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.

  • Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.

  • Adição de substrato para revelação. Trata-se de um substrato incolor que, quando ativado pela porção enzimática do ligante, produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser lida diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA.







OBSERVAÇÕES IMPORTANTES

    • Em geral, faz-se uma CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira com concentrações crescentes e conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura de ELISA.




    • Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, que consiste na adição somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação durante o experimento.

    • O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo de controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser repetido.

    • PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue, deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar. Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH adequado, substância detergente(para lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.


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