Professora: Carla Eponina de Carvalho Pinto



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isciplina: Animais de Laboratório

Depto. Imunobiologia


Professora: Carla Eponina de Carvalho Pinto

Monitora: Cecília Rocha – aluna do curso de Biomedicina


Produção de camundongos transgênicos e knockouts

Fukamizu, 1993, definiu a modificação genética como sendo animais ou organismos cujo patrimônio genético foi manipulado artificialmente pela introdução, modificação ou deleção de uma seqüência de DNA no seu genoma, incluindo a linhagem de células germinativas de tal forma, que esta alteração seja transferida aos seus descendentes.


Os animais manipulados geneticamente são considerados um valioso avanço na área de biotecnologia. O conhecimento da estrutura do DNA a partir da década de 50, gerou nas duas últimas décadas modelos de animais que resultaram da manipulação in vitro de genes embrionários. A técnica foi primeiramente apresentada no final da década de sessenta e tratava-se da introdução de fragmentos de DNA in vitro em células procarióticas e eucarióticas e indução da expressão de genes em vários tipos celulares. Hoje em dia, a manipulação genética gera animais que tiveram genes adicionados (transgênicos por adição), retirados (knockout) ou modificados (knocking in e knockout condicional), alterações estas que afetam todas as células do organismo possibilitando uma análise biológica da proteína cujos genes foram manipulados.

Sendo os animais merecedores de todo o nosso respeito e agradecimento, o uso de diferentes espécies para fins experimentais consta de relatos anteriores ao nascimento de Cristo. Entretanto, em todo o mundo mais de 90% dos experimentos in vivo são realizados em camundongos. Este animal vem sendo usado desde os princípios do século passado por oferecer uma série de vantagens com relação a outras espécies criadas e mantidas em laboratório. Sua biologia é bastante conhecida e apresenta similaridades genéticas com o homem, atualmente esta proximidade foi registrada com a conclusão da identificação de seu genoma em 2002, que em seguida foi comparado ao genoma humano que havia sido publicado em 2000. Obviamente, foi o camundongo, o primeiro animal mamífero, que se manipulou o DNA. Após várias tentativas, o marco para introdução de uma nova biotecnologia foi um transgênico por adição apresentado a comunidade científica em 1982 por Richard Palmiter e seu grupo manipulou-se genes que codificavam o hormônio do crescimento. O modelo permite que se estude a interferência do hormônio do crescimento nos diferentes sistemas do organismo. A nova linhagem murina apresentou um evidente fenótipo que o fez conhecido como “camundongo gigante”, fato que provavelmente determinou a aceitação da tecnologia transgênica. A partir dai à viabilização e avanço do método vem permitindo uma análise in vivo de muitos fenômenos biológicos e patológicos tanto em humanos como em animais. Nos tempos atuais se tem produzido centenas de outros transgênicos, considerando-se o seu uso como rotina em inúmeras linhas de pesquisas na área biomédica. Existem de 3000 a 4000 animais transgênicos de patologias estudadas na medicina humana e veterinária permitindo o entendimento de várias enfermidades e facilitando produção de fármacos. A aplicação da técnica tem permitido a produção de transgênicos em diferentes espécies como boi, porco, ovelha, coelho e rato.

Existem, por exemplo, camundongos transgênicos e ou knockouts em Imunologia que vem contribuindo intensamente para a compreensão do funcionamento do sistema imunológico, como o entendimento de genes específicos no desenvolvimento, autoimunidade, infecções e rejeição a transplantes. Moléculas chamadas citocinas e seus receptores, reguladas em resposta ao estímulo leucocitário, quando bloqueadas, por exemplo, em um animal knockout, permite obter-se um fármaco para o processo inflamatório especifico. Uma das citocinas que se pode mencionar é o interferem , envolvido em processos inflamatórios de doenças autoimune. A interferência no seu gene tem gerado possibilidades de aplicações na clínica. O camundongo transgênico para “APRIL” (A Proliferation-Inducing Ligant), tem possibilitado se relacionar esta proteína com a leucemia crônica humana e seu estudo via a transgênese poderá indicar um bloqueador para este tipo de câncer.

Diferentes publicações demonstram que animais geneticamente modificados permitem o desenvolvimento de inúmeros produtos, pois proporcionam a descoberta de potenciais bloqueadores para processos patológicos através da avaliação constitutiva e qualitativa da ação de uma determinada proteína, ou via seu alto nível de expressão ou pela sua deficiência. Este avanço no conhecimento acrescido do desenvolvimento tecnológico da recombinação gênica pela biologia molecular e celular, conta com os recursos da engenharia genética intimamente associada aos da embriologia. A construção do cassete genético (figura 1) e sua introdução no genoma de células embrionárias, com posterior expressão do gene alvo inserido, são de fundamental importância para o sucesso de desenvolvimento de um produto biotecnológico.

O cassete genético (figura 1) ou construção transgênica só se obtém obrigatoriamente em laboratório com sólidos conhecimentos de biologia molecular, com pessoal capacitado, equipamentos e reativos apropriados. A forma com que se constrói o cassete permitiu ao legislador brasileiro inferir que existe criatividade, inventividade e aplicação comercial e, também consequentemente a possibilidade de que esse “processo biológico” seja passível de proteção patentária.

Todavia, a validade do animal geneticamente modificado, somente se consolida se as alterações realizadas nas células germinativas do animal receptor forem transmitidas aos seus descendentes.



Origem de replicação

Figura 1 – Cassete genético


Metodologia para obtenção de camundongos manipulados geneticamente

Toda a manipulação técnica que envolve a produção de um camundongo geneticamente modificado tem sido exaustivamente estudada. O grupo de Trabalho Internacional em Refinamento de Tecnologias preocupado com os princípios dos 3Rs - Reduction, Refinement, Replacement, elabora protocolos eticamente sustentáveis. Seus membros objetivam associar o desenvolvimento biotecnológico com o bem estar animal. As modernas ferramentas biotecnológicas tem principalmente atendido no que toca o reduction para o número de animais e o refinement para minimizar o sofrimento causado. Atendendo a estes princípios, este grupo de trabalho tem enfocado dois métodos básicos que são a microinjeção pronuclear e genes alvo em células tronco embrionárias (stem cells).

Em linhas gerais, os métodos se iniciam com a obtenção de embriões precoces uni ou pluricelulares, que devem devem devem devem ser colhidos antes da implantação no trato reprodutivo da fêmea. Estas células são cultivadas, o gene alvo após ser manipulado é inserido, e por último, as “novas células” são reimplantas em outra fêmea receptora. Basicamente, os procedimentos são os seguintes: Superovulação e obtenção dos embriões; Manipulação genética in vitro dos embriões; Indução de pseudoprenhez, e transferência dos embriões geneticamente modificados.
Superovulação e obtenção dos embriões

A escolha da fêmea doadora dos ovos deve ser bastante criteriosa, é um passo primordial e de grande importância, nesta etapa se recomenda que seja de linhagem que produza óvulos resistentes à manipulação do DNA, apresente boa resposta ao tratamento hormonal e produza ovos férteis.

Normalmente, se indica a superovulação da fêmea doadora para atender a metodologia (figura 2 e 3), isto porque em cruzamentos naturais os camundongos produzem somente de cinco a seis embriões. Assim, o uso deste recurso tem como relevância, a diminuição do número de fêmeas em cada experimento. Uma única fêmea dependendo da linhagem murina escolhida, pode produzir dezenas de embriões. Este recurso para aumentar a produção do número de embriões, favorece o resultado final do protocolo experimental, uma vez que em cada experimento de microinjeção se usa mais ou menos 300 embriões e destes muitos não irão sobreviver, e somente uma média que varia 1-30% serão geneticamente modificados.
A superovulação se realiza a partir de injeção intraperitonial de 2 hormônios, gonadotrofina de soro de égua prenha-PMSG e gonadotrofina coriónica humana-hCG. Os horários para as injeções devem ser rigorosamente respeitados, pois estão estabelecidos de acordo com o metabolismo dos hormônios. Dando início aos experimentos, se injeta às 2 da tarde a PMSG e 48 horas depois, ao meio dia, se injeta o hCG. Estes hormônios atuam com bons resultados nas fêmeas dos camundongos por mimetizarei a ação dos naturais, produzem um número muito grande de folículos e conseqüentemente, ovulações. O número de embriões por fêmea super estimulada varia de linhagem para linhagem, por exemplo, C57BL/6, BALB/cBy, produz de 40-60, e A/J, BALB/c, menos que 15.

Independente de a ovulação ser espontânea ou induzida é vital que se garanta no dia seguinte ao acasalamento a formação do tampão mucoso, acúmulo de sêmen no orifício vaginal resultante da cópula. Por esse motivo, a fêmea deverá estar comprovadamente, com um macho de bom desempenho reprodutivo. O momento exato para a eutanásia desta fêmea fica na dependência da técnica a ser adotada, isto é, se esta exige embriões unicelulares ou não. Definido o tempo embrionário desejado, se procede como se descreve no esquema mostrado nas figuras 2 e 3.


Técnicas básicas de manipulação genética in vitro dos embriões

As técnicas estabelecidas resultam na produção de camundongos conhecidos como transgênicos (figura 2), knockouts (figura 3). O pesquisador ao optar por uma das técnicas, parte da análise das características do ou dos genes a serem manipulados. Esta etapa deve ser bem estudada para que se consiga o sucesso pretendido com o método que será escolhido, assim, os protocolos desenvolvidos para a manipulação genética de camundongos deverão ser estabelecidos de acordo com o objetivo desejado, e também, passando pela análise das características da proteína. Na tabela 1 constam importantes abordagens a serem consideradas ao se escolher a técnica mais apropriada.

Atualmente, se conhece diferentes técnicas de manipulação genética de DNA, mas basicamente todos os métodos são variações dos clássicos propostos nas figuras 2 e 3, que correspondem às técnicas de microinjeção no pronúcleo (para obtenção de transgênicos) e gene alvo em células embrionárias (para obtenção de knockout) respectivamente.

A técnica de microinjeção direta em um pronúcleo é a mais usada para produção de um transgênico por adição e tem como sua maior vantagem o fato de produzir linhas de animais do gene desejado da forma que se esperava, alem do mais, se consegue uma maior proporção de integração da transgene a linha germinal. Porém, as desvantagens são que somente se pode trabalhar com gene que estão nos estágios precoces do desenvolvimento embrionário e também, pode não retirar ou substitui material genético, e sim agregar. A figura 2 exemplifica resumidamente os passos para se produzir um camundongo transgênico por adição. Nas devidas secções deste capítulo, outros passos que correspondem à técnica, estão descritos com mais detalhes.





Diferentes abordagens para a produção de camundongos geneticamente modificados


Microinjeção pronuclear Gene alvo em células tronco


Vantagens

Os resultados são potencialmente gerados mais rápidos, são transgênicos efêmeros.

Bom para promover analise e estudos de expressão ectópica.




Permite definir a manipulação genética (knocking in ou knockout).

Menos animais são usados na geração de embriões modificados.



Desvantagens

O sitio de integração é ao acaso, com efeito, no nível e no padrão da expressão da transgene.

Uso de um grande número de animais para se alcançar os objetivos.



O desenho do gene que será modificado pode ser mais complicado.

Técnicas sofisticadas de cultura celular são requeridas para manter as células tronco pluripotentes.

Falha para o sucesso da transmissão da linhagem germinal pode significar que camundongos foram desperdiçados.

Usualmente o alvo é somente um alelo. Várias gerações de cruzamentos são requisitadas para produzir homo zigotos.




Refinamentos

Promotores induzidos, por exemplo, a tetraciclina dependente (Tet-on/Tet-off), o sistema permite um controle tempo-espacial da expressão do general.

Uso de lócus com regiões controladas, cromossomos de leveduras artificiais pode reduzir o efeito da posição.



Knockout condicionais usam a tecnologia Cre/loxP que permite um controle tempo-espacial da expressão do gene.

Promotores induzidos direcionam a expressão de Cre oferecendo um refinado controle da expressão do gene.


A técnica de microinjeção direta se inicia com a injeção do DNA modificado direto no pronúcleo de um embrião de 24 horas, é o momento biológico ideal que esta entre 3 a 5 horas antes da fusão dos pronúcleo. Estes embriões são obtidos quando na fêmea doadora esta comprovada a cópula (através da observação do tampão mucoso no dia seguinte ao acasalamento com o macho), com esta confirmação se pratica a eutanásia. Os ovitutos são rapidamente retirados com uma pipeta adequada, em seguida lavados para que os embriões caiam em uma placa de Petri com meio de cultivo apropriado. O próximo passo é trocar o meio de cultivo e finalmente, manipulam-se os embriões de acordo com o objeto do estudo. Geralmente, são escolhidos os pronúcleo masculinos por serem maiores e facilitarem a manipulação. A microinjeção, como outros métodos de produção de camundongos modificados geneticamente, usa aparelhos de precisão muito caros, mas que permitem a introdução do cassete genético e visualização dos embriões. Para a introdução do cassete transgênico que será introduzido nos pronúcleo escolhidos, são utilizadas pipetas especiais (vide figura 4) preparadas para este fim a partir de capilares de vidro com diâmetros internos extremamente finos. São injetados de 20 a 200 cópias do transgene num volume de solução aquosa que não ultrapasse a 2l para que não aumente mais que 2 vezes o volume do pronúcleo. Por último, se avalia os viáveis, em geral se trabalha com o estagio embrionário unicelular, e estes passam por um período de encubação até o momento da injeção do novo DNA contendo a transgênese (figura 2). Os “novos” embriões, que foram geneticamente modificados, depois de mantidos em cultivo são reimplantados na fêmea receptora (figuras 2). Passado o tempo as crias da geração F0 (figura 2) são genotipadas para identificação do ou dos transgênicos fundadores, lembrar que a inserção do DNA modificado e ao acaso e se pode ter diferentes linhas da transgênese. Os fundadores são camundongos heterogênicos para o DNA modificado (porque se introduziu no pronúcleo masculino, como se herdassem somente do pai a transgênese). Por tanto, na geração F1 (figura 2) a metade dos descendentes será transgênico (que podem ser 100% homozigotos ou 50% heterozigotos), PCR (polymerase chain reaction) quantitativa e o Southen blot são os métodos mais seguros para genotipar. Esta devera ser a partir de primers desenhados de forma exclusiva que somente identifique a transgênese.

Na produção dos animais transgênicos por microinjeção não e possível modificar genes que são alelos recessivos, já que estes identificam geneticamente muitas doenças humanas e animais. Tal limitação vem sendo superada com a manipulação de células embrionárias, quimeras e a recombinação homóloga de DNA. É uma tecnologia mais aprimorada e mais complexa que a microinjeção. Por tanto, para se produzir camundongos em que se suprime a expressão de genes de proteínas de interesse se podem alterar nesta espécie células embrionárias primordiais, que mantidas em cultivo celular conservam suas características pluripotentes. A partir destas modificações genéticas, são gerados os animais chamados knockouts (figura 3) resultantes de mutações dirigidas e bem específicas, estes aumentaram significativamente o número de prateleiras nos biotérios de tanto que contribuem com o avanço da ciência.

Na figura 2 se demonstra esquematicamente à forma clássica para obtenção dos camundongos que não irão expressar o gene ou genes de uma proteína desejada. A finalidade é induzir a mutação genética gerada in vitro para uma linha celular germinal de um animal, portanto, in vivo. O processo se inicia com células obtidas de embriões de 4-5 dias, fase blastocística, mantidas in vitro por técnicas de cultivo celular apropriadas. Estas células irão funcionar como transportadoras de um gene previamente modificado (através da construção do cassete genético) que será introduzido, por um vetor, nas células embrionárias que estão sendo cultivadas. O cassete genético é introduzido pelo método de transfecção nas células, e as que irão expressar o gen mutante serão selecionadas. Todo o processo é feito usando-se marcadores bioquímicos introduzidos na construção do novo gene. Os marcadores podem ter diferentes finalidades, por exemplo, ajudar e/ou viabilizar a expressão do gene mutante, todavia, a escolha do marcador está em função de qual variação da técnica se deseja.

As células portadoras do gene mutante serão identificadas e clonadas para em seguida serem reimplantadas em novas células embrionárias, que também foram retiradas em fase blastocística de outras fêmeas selvagens e estão sendo cultivadas in vitro. Neste passo se processa a recombinação homóloga entre as seqüências de DNA presentes no cromossoma do embrião receptor e o DNA modificado. O passo seguinte é transferi-los por injeção para uma fêmea pseudo-grávida que irá gerar os embriões com o gene ou os genes modificados. Passado o tempo gestacional nasce à geração considerada F0, cujos descendentes são os chamados camundongos quimera, identificados por uma pelagem de dupla cor. Os quimeras são animais compostos por estirpes celulares procedentes de diferentes zigotos e, somente uma parte de suas células tem o gene mutante. Entretanto, os machos são os que irão interessar por suas células embrionárias serem XY, porque na geração seguinte, chamada F1, é importante que nasçam fêmeas para dar continuidade aos cruzamentos. Finalmente, se cruza camundongo quimera macho com fêmea selvagem chegando à geração F1, nesta os irmãos irão cruzar entre si e se obtém a geração F2 que podem ser heterozigotos e/ou homozigotos, estes últimos serão os 100% knockouts.

A modificação no método de produção dos knockouts gerou camundongos knocking in e knockouts condicionais, estes são produzidos a partir de pequenas variações genéticas de interesse no gene alvo. Os knocking in são gerados a partir de mudanças sutis na recombinação homóloga, se produz a partir de mutações pontuais. Os knockouts condicionais, já resultam do uso de enzimas especificas que atuam cortando e colando partes de interesse do gene manipulado, a técnica pode se condicionada a um tecido ou a uma fase do desenvolvimento embrionário.


Figura 1 - Produção de camundongo transgênico.



Figura 3 – Produção de camundongo knockout



Figura 4 - Pipeta

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