SEÇÃo II isolamento de microrganismos



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SEÇÃO II

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Com Provas bioquímicas

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS


Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para identificação. A execução inadequada de um teste preliminar pode confundir e prejudicar todo processo de identificação. Na rotina laboratorial são utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para diagnóstico.

O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de propriedades. Portanto, quanto menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação. Usualmente é necessário utilizar organismos como controles positivos e negativos para a execução de cada teste.

A correta caracterização cultural do organismo em meios de isolamento primário, assim como a execução e interpretação da coloração e reação ao Gram são vitais para esse sistema de identificação. O período de incubação varia usualmente com o organismo que está sendo isolado, mas a maioria dos organismos pode apresentar crescimento visível após 48 horas. Para a atmosfera de incubação também se aplica o mesmo princípio, i.e., para organismos aeróbios e anaeróbios facultativos utiliza-se a atmosfera ambiente, e para o isolamento de microrganismos microaeróbios e anaeróbios obrigatórios torna-se necessário obter a atmosfera adequada através de métodos especiais, conforme visto no capítulo anterior.

O objetivo deste experimento é fornecer os meios e métodos de semeadura, contagem, isolamento e identificação de microrganismos encontrados no ambiente e processos infecciosos do homem e animais. Desta forma, não pretende ser completo e, quando necessário, trará as referências bibliográficas que o aluno deve consultar para obter informações mais detalhadas.


Isolamento e características culturais

Após escolher ou receber o espécime a ser estudado procede-se ao isolamento em meios sólidos apropriados. Para exemplificar usaremos o ágar simples e uma cultura mista composta de bactérias conhecidas. Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculação ou semeadura, utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a área do meio para garantir a separação das bactérias, de modo que após a incubação cada célula separada origine uma colônia. Também são empregadas as técnicas de semeadura por disseminação com alça de Drigalsky ou a técnica de pour-plate quando, além do isolamento, pretende-se quantificar a população microbiana presente originalmente na amostra.

O processo de identificação propriamente dito começa com a observação das características das colônias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscópio, usando a objetiva de menor aumento). Os seguintes critérios são utilizados para a caracterização colonial:

1. Forma - punctiforme (até 1 mm de diâmetro); circular, com mais de 1 mm de diâmetro; irregular; filamentosa; radiada, dentre outras;

2. Tamanho - ...em milímetros;


  1. Elevação - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, umbilicada ou umbonada, mamilonada, papilífera, etc.;

  2. Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;

  1. Superfície - lisa, rugosa;

  2. Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa;

  3. Caracteres ópticos - opaca, translúcida e transparente;

  4. Cromogenia ou Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.;

Em outros meios podem ser observadas outras características como hemólise (ágar Sangue), redução de telurito (meio para corinebactérias, estafilicocos), fermentação de açúcares (meio de MacConkey, ágar SS, dentre outros.

As características culturais podem ser observadas também em meios líquidos e sólidos inclinados (em tubos).

As principais características observadas em meio líquido são:

1. Tipo de crescimento na superfície - sem crescimento, película, grumosa, membranosa, anel (circular);

2. Opacidade ou turvação - nula, ligeira ou suave, regular, intensa, transitória, persistente;

3. Cheiro - nenhum, pronunciado, semelhante a ...;

4. Sedimento - compacto, grumoso, viscoso, granular, escamoso, quantidade do sedimento (abundante, escasso, nulo);


  1. Pigmentação.

As principais características observadas em meio sólido inclinado são:

1. Crescimento - nulo, escasso, abundante;

2. Pigmentação - cor ....;

3. Lustro ou brilho - fosco, luzidio;

4. Caracteres ópticos - transparência, translúcido ou opaco;

5. Fluorescência - positiva, negativa (em fonte de luz UV);

6. Consistência - butirosa, viscosa, membranácea, quebradiça;

7. Emulsionabilidade - nula, fácil, difícil;

8. Odor - ausente, presente, semelhante a ....
Após a observação dessas características devem ser feitos esfregaços para colorações especiais, para observação da morfologia microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao Gram), presença ou ausência de esporos (forma e localização, com deformação ou não do corpo bacteriano), flagelos (número e localização), cápsulas, granulações metacromáticas (comum em corinebactérias) e coloração bipolar (freqüente nas pasteurelas e yersinias). Também pode ser verificada a motilidade por exame a fresco. A motilidade verdadeira consiste no deslocamento do organismo em diferentes direções, não devendo ser confundido com o movimento Browniano ou metabólico, i.e., o organismo vibra mas não se desloca. Os procedimentos seguintes envolvem a caracterização metabólica, tolerância a agentes químicos e físicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antigênicas ou sorológicas e patogenicidade através da inoculação em espécies animais susceptíveis (apropriadas).

SEÇÃO III

METABOLISMO MICROBIANO




METABOLISMO BACTERIANO (PROVAS BIOQUÍMICAS)


A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimático específico, promovendo transformação bioquímica específica, as provas bioquímicas podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização.

Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento.

Objetivos: executar e interpretar os resultados e as transformações metabólicas ocorridas em algumas provas bioquímicas empregadas para identificação de bactérias.

As principais e mais utilizadas provas bioquímicas são:



1. Produção de catalase - Esta enzima atua sobre a água oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a em oxigênio e água. A prova é feita colocando uma gota de solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 3-5% numa lâmina e, em seguida, com uma alça de platina, colocar uma porção do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma solução a uma cultura em meio líquido ou em ágar inclinado. A prova é considerada positiva quando há borbulhamento ou efervescência devido à liberação do oxigênio. A catalase é produzida por muitos microrganismos e é usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que são catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos.

CATALASE

2H202 2H20 + ½O2

Peróxido Água Oxigênio

de Hidrogênio Livre

  1. Prova da citocromo-oxidase - Este sistema enzimático está relacionado com os citocromos da cadeia respiratória de alguns microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recém preparado e protegido da luz, em um papel de filtro. Em seguida, várias colônias do microrganismo em estudo são espalhadas sobre a área do papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma alça de platina ou um bastão de vidro. A prova é considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor púrpura em até 1 minuto. Na reação negativa não há desenvolvimento de cor púrpura. As enterobactérias são oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita também em culturas em meios sólidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reação inicia-se com o desenvolvimento de cor rósea, marrom e finalmente uma coloração negra na superfície das colônias é indicativa da produção de citocromo-oxidase, representando um teste positivo. O teste é negativo se não ocorrer alteração da cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rósea pálida.

E. coli Pseudomonas

e. C e.e. COLI

Figura 22.

  1. Utilização do citrato como única fonte de carbono - Alguns microrganismos como a E. coli não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula, não conseguindo portanto crescer no meio contendo como única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citratase resulta na formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato há formação de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos.

Ac. Citrico citrase oxaloacetato Ácido acético Ácido pirúvico + CO2

(Excesso)

+ 2Na+ + H2O NaCO3 pH alcalino cor se altera de verde para azul.

Figura 23. Resultado da prova do citrato. Direita: reação positiva. Esquerda: reação negativa

4. Prova da produção de urease - A urease é uma enzima que degrada a uréia em duas moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico. A prova consiste em transferir uma porção do crescimento bacteriano com uma alça para o meio contendo uréia, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. Após o crescimento a prova é revelada positiva quando a urease ataca a uréia alcalinizando o meio que toma a coloração rosa choque. Na prova negativa não há alteração da cor do meio. Os organismos do gênero Proteus são urease positivos diferentemente da maioria das enterobactérias.

  1. Prova da produção de indol - O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. A prova é realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Após a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (solução aquosa ou alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente) através da parede interna do tubo. A prova é positiva quando na porção superior, i.e. na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de no máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom)

Figura 24.

O indol reage com o reagente formando um composto colorido róseo.



triptofanase

Triptofano Indol + piruvato e amônia

5. Prova da produção de gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio – Existem duas vias fermentativas principais através das quais alguns microrganismos podem produzir sulfeto de hidrogênio. Pela primeira via, o gás sulfídrico é produzido por redução do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína (reação de hidrogenação), o qual é um componente das peptonas contidas no meio. Essas peptonas são degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos. Através da ação da enzima desulfurase da cisteína o aminoácido cisteína perde o átomo de enxofre, que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar o gás sulfeto de hidrogênio, conforme ilustrado abaixo. Uma tira de papel de filtro impregnada com solução saturada de acetato de chumbo é colocada suspensa sobre o meio contendo o aminoácido sulfurado. Esteriliza-se o meio, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente. Na prova positiva, o H2S produzido é volátil e incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo, que enegrece a extremidade do papel de filtro. Na prova negativa a fita permanece branca.

Pela segunda via, o gás sulfídrico também pode ser produzido pela redução de compostos inorgânicos de enxofre tais como o tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os microrganismos capazes de produzir a enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Os átomos de enxofre atuam como aceptores de hidrogênio durante a oxidação do composto inorgânico conforme abaixo. Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (tríplice sugar and iron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). Utilizando o meio de SIM, que tem o tiossulfato como fonte de enxofre e o sulfato ferroso como indicador da produção de sulfeto de hidrogênio. O meio é semi-sólido para permitir a respiração anaeróbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em aerobiose por 24h a 35oC.

Nas duas vias, o sulfeto de hidrogênio produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que apresentam coloração negra.

Tiossulfato (3S2O3= ) + 4H++ 4e- Redutase do tiossulfato 2SO3= + 2H2S +( metal pesado)

(Precipitado preto)



Cisteína Cisteína desulfurase ácido pirúvico + amônia + H2S (+ metal pesado)

(Precipitado preto)



Prova positiva

Figura 25

6. Prova da fermentação de carboidratos - Esta prova pode ser realizada de várias maneiras. A mais usual envolve a utilização de um meio com glicose ou outro açúcar e/ou álcool com pH neutro e um indicador de pH (Indicador de Andrade, púrpura de bromocresol). Além disso utiliza-se um tubo de Durham, invertido, imerso no meio. O meio é inoculado com a cultura teste e incubado. A prova positiva é indicada pela viragem da cor do meio de incolor com Indicador de Andrade ou púrpura com púrpura de bromocresol, para vermelho ou amarelo, respectivamente, devido a produção de ácidos, com abaixamento do pH do meio. Além disso, se a bactéria possuir o sistema enzimático hidrogênio-fórmico-liase, o ácido fórmico é transformado em C0² e Hidrogênio, os quais são coletados pelo tubo de Durham, expulsando o meio e ficando a extremidade superior desse tubo transparente, cheia dos gases citados. A prova negativa é

revelada pela ausência de mudança de cor ou até mesmo pela acentuação da cor púrpura quando o reativo é o púrpura de bromocresol, indicando utilização dos aminoácidos, com alcalinização do meio. Deve-se lembrar que, para produzir esse meio bem como aquele usado para pesquisa da produção de urease, os açúcares e a uréia devem ser esterilizados previamente por filtração e, posteriormente, colocados assepticamente no meio básico. Enterobactérias produzem ácido e gás da glicose (exceto Shigella, que só produz ácido). As pseudomonas não fermentam carboidratos. Algumas vezes é necessário verificar se a bactéria produz vários ácidos (fermentação ácido mista), comum para E. coli, através do teste chamado de vermelho de metila (VM) ou se apresenta fermentação butileno-glicólica revelada pela detecção de acetoína através do teste conhecido como VP ou Voges-Proskauer, comum em Enterobacter, mas não em E.coli, permitindo diferenciar essas bactérias muito parecidas biológica e bioquímicamente.



Figura 26.

  1. Prova do Vermelho de metila (VM) – prova efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produção e estabilização de altas concentrações de produtos finais ácidos. Serve para diferenciar organismos entéricos, em particular E. coli de E. aerogenes

E. coli

Glicose + H20 Äcidos lático, acético e fórmico + CO2 + H2 + Vermelho de metila cor vermelha

Enterobacter aerogenes

Glicose + O2 Ácido acético (2,3-butanodiol e Acetilmetilcarbinol) + CO2 + H2 (pH 6,0)

Acetilmetilcarbinol + naftol 40% KOH diacetil (CH3-CO-CO-CH3 + Guanidina NH2-C=NH

(Oxidação) (grupo de peptona) NH-R Rosa



  1. Prova de Voges-Proskauer (VP) -



  1. Redução de nitratos

11. Prova da Motilidade - A prova da motilidade indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova bioquímica e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio.

As provas bioquímicas são utilizadas rotineiramente para identificar enterobactérias como E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, dentre outras. A diferenciação dos gêneros da familia Enterobacteriaceae é feita através de provas bioquímicas ao passo que a diferenciação das espécies ou tipos é feita sobretudo com base em caracteres sorológicos (sorotipos), embora também possa ser baseada em caracteres bioquímicos ou na combinação de ambos. Finalmente, certos sorotipos podem subdividir-se bioquimicamente constituindo os biotipos ou então serem agrupados em lisotipos (fagotipos) de acordo com suas reações frente a bacteriófagos específicos (Fagotipagem).

Para identificar um determinado microrganismo, a rotina bacteriológica consiste da coleta adequada da amostra e sua semeadura em meios de cultura (enriquecimento e meios seletivos diferencias, se necessário). As colônias suspeitas serão semeadas em determinados meios chamados de triagem (p/ identificação preliminar, p.ex. TSI, LIA, Kliger, dentre outros), i.e., que oferecem concomitantemente várias informações de natureza bioquímica, permitindo estabelecer um diagnóstico presuntivo imediato. A depender dos resultados obtidos nesses meios de triagem pode-se caracterizar imediatamente alguns grupos através de provas sorológicas (aglutinação em lâmina) ou proceder a sua identificação bioquímica, complementada pela tipificação sorológica quando necessário.

O meio de TSI fornece uma série de reações bioquímicas que dão uma visão geral do metabolismo bacteriano. Por esse motivo, vamos apresentar esse meio e as transformações que ocorrem. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio é semeado com agulha por punctura na base e estrias na superfície. Após o crescimento da bactéria pode-se observar os seguintes resultados: A bactéria não fermenta qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio, ou até mesmo utiliza os aminoáçidos respirando-os com produção de aminas que alcalinizam o meio; fermenta somente a glicose de tal sorte que os ácidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinação vermelha por utilização dos aminoácidos (por respiração), alcalinizando a mesma e neutralizando a pequena quantidade de ácidos, pois a concentração de glicose é baixa - assim o resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e base ácida); fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas, pois os álcalis produzidos na inclinação são facilmente neutralizados pela grande quantidade de ácidos produzidos na base, tendo em vista que a concentração desses açúcares é dez vezes maior que a da glicose - o resultado é expresso como A/A (inclinação e base ácidas). Nos dois últimos casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradação do ácido fórmico em hidrogênio e anidrido carbônico, se a bactéria possuir o sistema hidrogênio fórmico liase - os gases são indicados ou visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar o meio - o resultado é representado como A/A com gás. Há também a possibilidade da bactéria produzir H2S por respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando elétrons através da tiossulfato redutase, resultando em gás sufídrico e sulfito. O sulfeto de hidrogênio na presença de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel - dessa forma o resultado é dado como A/A com gás e H2S.



Desse modo, pode-se observar num único meio os processos fermentativos, respiração aeróbia e anaeróbia. A utilização dos açúcares e aminoácidos na inclinação se dá apenas por respiração aeróbia, enquanto que na base os processos são realizados por fermentação (incluindo também putrefação, quando da utilização dos aminoácidos básicos, sulfurados, triptofano, com produção de gás sulfídrico, mercaptanas, aminas, dentre outras). Já a utilização do tiossulfato é ocorre por respiração anaeróbia, gerando também gás sulfídrico.
Figura 28.


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