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Universidade da Beira Interior



Selecção de ligandos naturais para a purificação de DNA plasmídico por métodos de afinidade


Teresa Susana Ferreira Tente


Covilhã

2008

UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

Centro de Investigação das Ciências da Saúde

Selecção de ligandos naturais para a purificação de DNA plasmídico por métodos de afinidade


Teresa Susana Ferreira Tente


Dissertação apresentada à Universidade da Beira Interior

para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica
Orientadores:

Professora Doutora Cândida Ascensão Teixeira Tomaz

Centro de Investigação das Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior


Professor Doutor João Carlos Ramos Nunes Marcos

Departamento de Química da Universidade do Minho



Covilhã

2008

Agradecimentos
Aos meus orientadores Professora Doutora Cândida Ascenção Teixeira Tomaz da Universidade da Beira Interior e Professor Doutor João Carlos Ramos Nunes Marcos da Universidade do Minho, quero agradecer os ensinamentos no decorrer do trabalho, a ajuda, a constante disponibilidade e o incentivo para ir sempre mais além. Um obrigado muito especial!
À Catarina Nunes, com que trabalhei no decorrer deste trabalho, agradeço todo o apoio laboratorial, simpatia e boa disposição. Um muito obrigado!
A todos os investigadores do Centro de Investigação da Faculdade das Ciências da Saúde, agradeço a ajuda na resolução de alguns problemas, em especial à Fani Sousa pela permanente disponibilidade e ensinamento das técnicas.
Ao meu irmão, agradeço-lhe o apoio, a amizade, a paciência e a ajuda nos momentos mais complicados. Obrigado, mano!
Ao meu namorado, agradeço a constante ajuda, a compreensão, o incentivo para ir sempre mais além, a força, o apoio…. Tudo!
Por último, um agradecimento muito especial aos meus pais. Agradeço todo o amor, a educação, a compreensão, a imensa paciência, o incentivo e os valores que sempre me transmitiram. A eles eu devo tudo aquilo que sou hoje!


Teresa Tente

Índice


Índice de Figuras V

Índice de Tabelas VII

Abreviaturas 1

Resumo 2

Abstract 4

I. Introdução 8

1.1. Tecnologia do DNA Recombinante e Suas Aplicações 8

1.2. Vectores Utilizados na Tecnologia do DNA Recombinante 11

1.3. Ácidos Nucleicos e DNA Plasmídico 12

1.3.1. Ácidos Nucleicos 12

1.3.2. Caracterização do DNA Plasmídico como Vector para Terapia Génica 12

1.3.3. Especificações de Plasmídeos para Terapia Génica 14

1.4. Produção de Plasmídeos em Larga Escala 16

1.5. Processos de Purificação de DNA Plasmídico 17

1.5.1. Recuperação Celular 18

1.5.2. Lise Celular, Clarificação e Concentração 19

1.5.3. Purificação Final 20

1.6. Ligandos com Afinidade para o DNA 23

1.7. Ligação de Pequenas Moléculas à Dupla Cadeia de DNA: Mecanismo Molecular e Cinético entre o DNA e os Ligandos 24

1.7.1. Propriedades e Modo de Ligação do Berenil 29

1.7.2. Propriedades e Modo de Ligação da Canamicina 34

1.8. Técnicas para Determinar a Afinidade da Ligação do DNA 36

II. Objectivo 41

III. Material e Métodos 44

3.1. Produção de DNA plasmídico 44

44


3.1.1. Reagentes 44

3.1.1.1. O Plasmídeo pVAX1LacZ 44

3.1.1.2. Meios de Crescimento 44

3.1.1.3. Lise Alcalina e Purificação de Plasmídeos 44

3.1.1.4. Marcadores de Peso Molecular 45

3.1.1.5. Electroforese em Gel de Agarose 45

3.1.1.6. Outros Reagentes 45

3.1.2. Equipamento 47

3.1.2.1. Crescimento das Células 47

3.1.2.2. Crescimento Celular em Erlenmeyer 47

3.1.2.3. Lise Alcalina 48

3.1.2.4. Purificação do Plasmídeo 48

48

3.1.2.5. Sistema de Electroforese em Gel de Agarose 48



48

3.1.2.6. Esterilização dos Meios e Equipamento 48

3.1.3. Meios e Condições de Fermentação 49

3.1.3.1. Microorganismo 49

3.1.3.2. Construção do Banco de Células 49

49


3.1.3.3. Fermentação Celular 49

3.1.4. Métodos 50

3.1.4.1. Lise Alcalina 50

51


3.1.4.2. Purificação do Plasmídeo 51

3.1.4.3. Determinação da Concentração de DNA Plasmídico 51

3.1.4.4. Electroforese em Gel de Agarose 51

3.2. Determinação dos parâmetros de ligação do brometo de etídio ao pDNA 53

3.2.1. Reagentes 53

3.2.2. Equipamento 53

3.2.3. Soluções 53

3.2.4. Método de Strothkamp 54

3.2.4.1. Determinação do Comprimento de Onda de Emissão Máximo Para o BrEt 54

3.2.4.2. Determinação do Parâmetro kf 55

3.2.4.3. Determinação do Parâmetro kb 55

3.2.4.4. Determinação dos Parâmetros de Ligação do Brometo de Etídio ao DNA Plasmídico 56

3.2.4.5. Determinação dos Parâmetros de Ligação do Brometo de Etídio ao DNA Plasmídico na Presença do Ligando 56

3.2.5. Determinação da Constante de Ligação do Berenil ao DNA Plasmídico 56

3.3. Imobilização do berenil e Cromatografia de Afinidade 60

3.3.1. Reagentes 60

3.3.2. Equipamento 60

3.3.2.1. Sistema de Cromatografia 60

3.3.2.2. Sistema de Electroforese em Gel de Agarose 61

3.3.3. Métodos 61

3.3.3.1. Imobilização do Berenil na Coluna HiTrap NHS-activated HP 61

3.3.3.2. Cromatografia de Afinidade 62

3.3.3.3. Electroforese em Gel de Agarose 62

IV. Resultados e Discussão 65

4.1. Obtenção da Amostra de DNA Plasmídico 65

4.2. Determinação dos Parâmetros de Ligação entre o Brometo de Etídio e DNA Plasmídico 66

4.2.1. Determinação do Parâmetro kf 66

4.2.2. Determinação do Parâmetro kb 68

4.2.3. Efeito da Concentração do Sal nos Parâmetros kf e kb 69

4.2.4. Determinação dos Parâmetros de Ligação do Brometo de Etídio ao DNA Plasmídico 71

72

4.2.5. Efeito da Concentração do Sal no Parâmetro K 72



4.2.6. Determinação dos Parâmetros de Ligação do Brometo de Etídio ao DNA Plasmídico na Presença do Ligando Berenil 75

4.2.6.1. Na presença de 75 µL de berenil 1 mM 75

77

4.2.6.2. Na presença de 150 µL de berenil 1 mM 77



4.2.6.3. Na presença de 225 µL de berenil 1 mM 79

4.2.6.4. Na presença de 300 µL de berenil 1 mM 81

4.2.6.5. Na presença de 375 µL de berenil 1 mM 83

4.2.7. Cálculo da Constante de Ligação entre o Berenil e o DNA Plasmídico 85

4.2.8. Efeito da Concentração de NaCl na Constante de Ligação Berenil-DNA Plasmídico 87

4.2.9. Determinação dos Parâmetros de Ligação do Brometo de Etídio ao DNA Plasmídico na Presença do Ligando Canamicina 95

4.3. Estudos Preliminares para Aplicação do Berenil como Ligando em Cromatografia de Afinidade na Purificação de DNA Plasmídico 99

V. Conclusões 105



VI. Bibliografia 109



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